识别增强型亚稳态核酸适配体探针及在目标物质计数分析中的应用制造技术

本发明专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针，熔炼温度Tm低于45℃，为末端互补的发卡形结构；当有目标物质存在时，该核酸适配体探针能够与目标物质结合，并进而打开其末端茎部，通过聚合酶的作用引发滚环扩增反应，当无目标物质存在时，该核酸适配体探针形成闭合结构，并可通过延长末端茎部使其双链结构更稳定，不能在聚合酶的作用下引发滚环扩增反应。优选的识别增强型亚稳态核酸适配体探针，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所述。该识别增强型亚稳态核酸适配体探针在目标物质计数分析中应用，可提升对目标分子的响应灵敏性和识别效率，回收率达88～110％。

Recognition of Enhanced Metastable Nucleic Acid Adaptor Probes and Their Application in Target Substance Counting and Analysis

The enhanced metastable nucleic acid aptamer probe is a hairpin structure with complementary ends when the melting temperature is lower than 45 C. When there is a target substance, the aptamer probe can bind to the target substance, and then open the end stem of the aptamer probe, trigger a ring-rolling amplification reaction by the action of the polymerase, and when there is no target substance, the aptamer probe can bind to the target substance. Closed structure can be formed and the double-stranded structure can be more stable by elongating the terminal stem, which can not trigger the ring-rolling amplification reaction under the action of the polymerase. The preferred probes for identifying enhanced metastable nucleic acid aptamers are SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:3 in the sequence list. The application of the enhanced metastable nucleic acid aptamer probe in target substance counting analysis can improve the sensitivity and recognition efficiency of the target molecule, and the recovery rate is 88-110%.

【技术实现步骤摘要】
识别增强型亚稳态核酸适配体探针及在目标物质计数分析中的应用
本专利技术属于核酸适配体探针
，特别涉及识别增强型亚稳态核酸适配体探针及其在目标物质计数分析中的应用。
技术介绍
核酸适配体是一类具有分子识别性的功能核酸，是能够与靶分子高亲和力和高特异性结合的单链DNA或RNA。相比抗体，核酸适配体具有结构响应性、稳定和廉价等优势，它可以通过不依赖靶标分子抗原性的体外筛选过程高效获取，因此特别适用于构建只有低抗原性的小分子的高效识别元件。然而核酸适配体和目标分子的结合效率是需要解决的关键问题，由于现有技术公开的核酸适配体探针难以既保持自身核酸结构的稳定性(双链杂交的解离常数Kd值＜10-9M)，又对弱结合力的目标分子的结合作用进行有效响应(适配体与目标分子作用的解离常数Kd值一般在10-5-10-9M之间)，因此会导致核酸适配体探针对目标分子的识别效率低，只有高浓度的目标分子才能产生检测信号。为了提高核酸适配体探针对目标分子的响应性和识别效率，提升基于核酸适配体的传感分析方法的灵敏度和准确定量性，势必需要设计和合成新的核酸适配体探针。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的不足，提供识别增强型亚稳态核酸适配体探针，以提高对目标分子的响应性和识别效率。本专利技术的再一目的是提供识别增强型亚稳态核酸适配体探针在目标物质计数分析中的应用，以提升基于核酸适配体的传感分析方法的灵敏度和准确定量性。本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针，其熔炼温度Tm低于45℃，为末端互补的发卡形结构，包括双链的茎部和单链的环部，所述茎部互补碱基小于5个；当有目标物质存在时，该核酸适配体探针能够与目标物质结合，并进而打开其末端茎部，通过phi29DNA聚合酶的作用引发滚环扩增反应，当无目标物质存在时，该核酸适配体探针形成闭合结构，并可通过延长末端茎部使其双链结构更稳定，不能在phi29DNA聚合酶的作用下引发滚环扩增反应，从而降低背景信号。本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针，优选下述三种：第一种识别增强型亚稳态核酸适配体探针，核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述，其可结合的目标物质为赭曲霉毒素A，命名为RMSApt-OTA。第二种识别增强型亚稳态核酸适配体探针，核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：2所述，其可结合的目标物质为卡那霉素，命名为RMSApt-Kana。第三种识别增强型亚稳态核酸适配体探针，核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：3所述，其可结合的目标物质为L-酪氨酸胺，命名为RMSApt-L-Tyrosinamide。本专利技术通过实验证明，上述识别增强型亚稳态核酸适配体探针可在目标物质计数分析中应用，实现适配体与目标分子作用解离常数Kd值在10-5-10-9M之间的目标分子高灵敏检测。本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针在目标物质计数分析中的应用，步骤如下：(1)制备用于滚环扩增的环形探针将成环探针进行磷酸化反应，然后在连接酶的作用下将磷酸化反应后的成环探针连接成封闭的环形探针，再加入核酸外切酶切掉多余的碱基片段获得纯净的封闭环形探针，继后将含封闭环形探针的体系加热到75～85℃保持15～20min使连接酶和核酸外切酶失活；(2)建立目标物质计数分析用的标准曲线配制一系列不同浓度待测目标物质标准品的水溶液，然后将不同浓度待测目标物质标准品的水溶液分别与退火处理后的识别增强型亚稳态核酸适配体探针、phi29DNA聚合酶缓冲溶液、延长酶和dNTPs混合均匀并在常温下静置50～60min，进行目标物质识别，并打开识别增强型亚稳态核酸适配体探针末端茎部的双链互补结构，再加入phi29DNA聚合酶、步骤(1)制备的环形探针进行滚环扩增，滚环扩增完成后在60～65℃保持8～10min使phi29DNA聚合酶失活终止反应，继后加入荧光染料YOYO-1进行DNA染色，并用荧光显微镜对所述核酸适配体探针扩增产物进行成像和计数分析，建立以成像视野内核酸适配体探针扩增产物计数为纵坐标、待测目标物质浓度为横坐标的标准曲线；(3)实际样品所含目标物质的计数分析将待测实际样品与退火处理后的识别增强型亚稳态核酸适配体探针、phi29DNA聚合酶缓冲溶液、延长酶和dNTPs混合均匀并在常温下静置50～60min，进行目标物质识别，并打开识别增强型亚稳态核酸适配体探针末端茎部的双链互补结构，再加入phi29DNA聚合酶、步骤(1)制备的环形探针进行滚环扩增，滚环扩增完成后在60～65℃保持8～10min使phi29DNA聚合酶失活终止反应，继后加入荧光染料YOYO-1进行DNA染色，并用荧光显微镜对所述核酸适配体探针扩增产物进行成像和计数分析，将计数结果对照标准曲线即可得到实际样品所含目标分子物质的浓度。上述应用中，所述目标物质为赭曲霉毒素A时，识别增强型亚稳态核酸适配体探针为RMSApt-OTA，它的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述，成环探针的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：4所述，命名为Circularprobe-1。上述应用中，所述目标物质为卡那霉素时，识别增强型亚稳态核酸适配体探针为RMSApt-Kana，它的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：2所述，成环探针的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：4所述，命名为Circularprobe-1。上述应用中，所述目标物质为L-酪氨酸胺时，识别增强型亚稳态核酸适配体探针为RMSApt-L-Tyrosinamide，它的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：3所述，成环探针的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：5所述，命名为Circularprobe-2。本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术提供的识别增强型亚稳态核酸适配体探针，为核酸适配体增加了新的种类。2、将本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针用于目标物质的计数分析，可提升适配体探针对目标分子的响应灵敏性和识别效率，实验表明，本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针用于目标物质的计数分析，回收率高，可达88％～110％(见实施例7、8、9)。3、实验表明，本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针用于计数分析，对目标物质选择性好，抗干扰能力强(见实施例7、8、9和对比例1、2、3)。4、将本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针用于目标物质的计数分析，整个过程在均相体系中完成，操作大大简化，克服了传统分析检测方法中样品清理及富集的过程使得操作复杂、测试周期长等问题，并可减少样品异质性和前处理操作的差异等因素造成检测结果的误差。附图说明图1是本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针RMSApt在目标物质计数分析中应用的反应示意图。图2是本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针RMSApt-OTA用于赭曲霉毒素A计数分析的标准曲线。图3是本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针RMSApt-OTA在计数分析中的选择性实验结果图。图4是本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针RMSApt-Kana用于卡那霉素计数分析的标准曲线。图5是本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针RMSApt-Kana在计数分析中的选择性实验结果图。图6是本专利技术所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针RMSApt-L-Tyrosinamide用于L-酪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.识别增强型亚稳态核酸适配体探针，其特征在于该核酸适配体探针的熔炼温度Tm低于45℃，为末端互补的发卡形结构，包括双链的茎部和单链的环部，所述茎部互补碱基小于5个；当有目标物质存在时，该核酸适配体探针能够与目标物质结合，并进而打开其末端茎部，通过phi 29DNA聚合酶的作用引发滚环扩增反应，当无目标物质存在时，该核酸适配体探针形成闭合结构，并可通过延长末端茎部使其双链结构更稳定，不能在phi 29DNA聚合酶的作用下引发滚环扩增反应。

【技术特征摘要】
1.识别增强型亚稳态核酸适配体探针，其特征在于该核酸适配体探针的熔炼温度Tm低于45℃，为末端互补的发卡形结构，包括双链的茎部和单链的环部，所述茎部互补碱基小于5个；当有目标物质存在时，该核酸适配体探针能够与目标物质结合，并进而打开其末端茎部，通过phi29DNA聚合酶的作用引发滚环扩增反应，当无目标物质存在时，该核酸适配体探针形成闭合结构，并可通过延长末端茎部使其双链结构更稳定，不能在phi29DNA聚合酶的作用下引发滚环扩增反应。2.根据权利要求1所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针，其特征在于它的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述，其可结合的目标物质为赭曲霉毒素A。3.根据权利要求1所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针，其特征在于它的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：2所述，其可结合的目标物质为卡那霉素。4.根据权利要求1所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针，其特征在于它的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：3所述，其可结合的目标物质为L-酪氨酸胺。5.权利要求1所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针在目标物质计数分析中的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于步骤如下：(1)制备用于滚环扩增的环形探针将成环探针进行磷酸化反应，然后在连接酶的作用下将磷酸化反应后的成环探针连接成封闭的环形探针，再加入核酸外切酶切掉多余的碱基片段获得纯净的封闭环形探针，继后将含封闭环形探针的体系加热到75～85℃保持15～20min使连接酶和核酸外切酶失活；(2)建立目标物质计数分析用的标准曲线配制一系列不同浓度待测目标物质标准品的水溶液，然后将不同浓度待测目标物质标准品的水溶液分别与退火处理后的识别增强型亚稳态核酸适配体探针、phi29DNA聚合酶缓冲溶液、延长酶和dNTPs混合均匀并在常温下静置50～60min，进行目标物质识别，并打开识别增强...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓锐杰，夏许寒，何强，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51