一种检测外泌体的适配体组、侧流式适配体生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种检测外泌体的适配体组、侧流式适配体生物传感器及其制备方法，属于外泌体检测技术领域。检测外泌体的适配体组包括CD63适配体和EpCam适配体，CD63适配体能特异性与外泌体的CD63蛋白结合，EpCam适配体能特异性与外泌体的EPCAM蛋白结合，两种适配体组不易受pH、温度等环境因素影响稳定性好。本发明专利技术还提供侧流式适配体生物传感器，主要基于层析试纸条原理将CD63适配体喷涂于结合垫上，将EpCam适配体喷涂形成检测线上，质控线上喷涂有能与纳米金标记的适配体的DNA探针通过碱基互补配对结合。测流式适配体生物传感器可以检测到500000个外泌体，为癌症快速筛查和诊断提供了革新的工具。

An adaptor for detecting exosomes, a side-flow adaptor biosensor and its preparation method

The invention provides an adaptor for detecting exosomes, a side-flow adaptor biosensor and a preparation method thereof, belonging to the technical field of exosome detection. The adapters for detecting exosomes include CD63 adapter and EpCam adapter. CD63 adapter can specifically bind to CD63 protein of the exosome. EpCam adapter can specifically bind to EPCAM protein of the exosome. The two adapters are not easily affected by environmental factors such as pH and temperature. The invention also provides a side-flow aptamer biosensor. The CD63 aptamer is sprayed on the bonding pad based on the principle of chromatographic strip, the EpCam aptamer is sprayed on the detection line, and the DNA probe with aptamer labeled with gold nanoparticles is sprayed on the quality control line through base complementary pairing. The flow-measuring adapter biosensor can detect 500,000 exosomes, providing an innovative tool for rapid cancer screening and diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
一种检测外泌体的适配体组、侧流式适配体生物传感器及其制备方法
本专利技术属于外泌体检测
，具体涉及一种检测外泌体的适配体组、侧流式适配体生物传感器及其制备方法。
技术介绍
外泌体(exosome)是由多种活细胞分泌的囊泡小体，其中含有蛋白质和RNA等多种组分。这种机体内普遍存在的纳米级被膜结构能够参与细胞间的物质交换和信息交流，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。外泌体在外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等体液中具有很高的丰度，而不同组织来源的外泌体在组成和功能方面存在差异，同时这种差异受到细胞外基质和微环境的动态调控。肿瘤来源或肿瘤相关的外泌体是调控肿瘤发生发展的重要机制，对肿瘤外泌体的分析和检测可以辅助肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析。外泌体作为生物标志物虽然还处于起步阶段，但随着进一步的研究，外泌体的临床应用将会有良好的前景。目前，应用电镜可以直接观察外泌体形态，应用Westernblot法可以根据外泌体表面的标志物CD9、CD63等跨膜分子，利用CD9、CD63单克隆抗体与相应抗原结合，检测外泌体蛋白表达量。应用PCR或测序的方法对外泌体内含有的遗传信息物质进行分析是目前应用越来越广泛的检测方法，其他还有一些鉴定技术如动态光散射技术，流式细胞术分析，纳米微粒追踪分析、电化学、荧光、SPR、SPRI、颜色分析等。上方法或者需要昂贵的大型仪器，或者需要复杂的操作步骤，不利于广筛。检测外泌体的方法还包括酶联免疫分析、免疫印迹分析。虽然利用抗原抗体免疫分析能取得较高的检测灵敏度，也不需要大型仪器，但是筛选与外泌体表面标志蛋白特异性结合的抗体往往步骤复杂，同时抗体蛋白质易受pH、温度等环境因素影响而变性、且合成价格昂贵。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种合成更容易，稳定性好的检测外泌体的适配体以及适配体组，同时本专利技术提供还提供了一种检测灵敏度高、简便快捷、不需要复杂昂贵的仪器设备且价格低廉的侧流式适配体生物传感器及其制备方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种检测外泌体的CD63适配体，所述CD63适配体组的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。本专利技术提供了一种检测外泌体的适配体组，所述适配体组包括CD63适配体和EpCam适配体，所述EpCam适配体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。本专利技术提供了一种侧流式适配体生物传感器，包括底板和粘附在所述底板上由下向上依次连接的结合垫、检测垫和吸收垫，所述检测垫包括检测线和质控线，所述结合垫喷涂有纳米金标记的CD63适配体偶合物，所述检测线喷涂有链霉亲和素-生物素标记的EpCam适配体偶合物，所述质控线喷涂有链霉亲和素-生物素标记的DNA探针，DNA探针的核苷酸序列与CD63适配体的核苷酸序列的3′端序列互补；所述纳米金标记的CD63适配体偶合物中CD63适配体为所述检测外泌体的CD63适配体；优选的，所述链霉亲和素-生物素标记的DNA探针中DNA探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。优选的，所述纳米金标记的CD63适配体偶合物的喷涂量为3μL/cm结合垫。优选的，所述链霉亲和素-生物素标记的EpCam适配体偶合物的喷涂次数为3次；所述链霉亲和素-生物素标记的EpCam适配体偶合物的喷涂体积为3μl/cm检测垫。本专利技术提供了侧流式适配体生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)在震荡条件下向纳米金溶液中依次加入dATP溶液、SDS溶液和NaCl溶液进行反应，得到的反应液和CD63适配体混合，在60℃下反应3h，固液分离，将所得沉淀溶解于纳米粒子存储液中，得到纳米金标记的CD63适配体偶合物溶液喷涂在结合垫上，得到喷涂有纳米金标记的CD63适配体偶合物的结合垫；(2)将生物素标记的EpCam适配体和链霉亲和素混合培养1h后，置于超滤离心管中超滤离心，对超滤离心管洗涤2次后，收集的上清液为链霉亲和素-生物素标记的EpCam适配体溶液；(3)用DNA探针替换所述步骤(2)中的EpCam适配体，重复步骤(3)操作，得到链霉亲和素-生物素标记的DNA探针溶液；(4)将所述步骤(2)中的链霉亲和素-生物素标记的EpCam适配体溶液和(3)中链霉亲和素-生物素标记的DNA探针溶液先后在检测垫上划线，得到喷涂有检测线和质控线的检测垫；(5)将所述步骤(1)中的喷涂有纳米金标记的CD63适配体偶合物的结合垫、所述步骤(4)中的喷涂有检测线和质控线的检测垫和吸水纸分别裁剪后由下向上依次组装在底板上，切条，得到侧流式适配体生物传感器；所述步骤(1)和(2)～(4)之间没有时间顺序的限制，同时步骤(2)和步骤(3)之间也没有时间顺序的限制。优选的，所述步骤(1)中纳米金溶液、dATP溶液、SDS溶液和NaCl溶液的体积比为200:2:3:10；所述纳米金溶液的浓度为15～20nmol/L，所述dATP溶液的浓度为1mmol/L，所述SDS溶液的质量浓度为1％，所述NaCl溶液的浓度为0.2mol/L。优选的，所述步骤(1)中存储液包括以下含量的组分：20mmol/LNa3PO4·12H2O，质量浓度5％BSA，质量浓度0.25％Tween20和质量浓度10％蔗糖。优选的，所述步骤(2)中固液分离的方式包括离心；所述离心的转速为6000rpm，所述离心的时间为20min，所述离心的温度为4℃。本专利技术提供了一种检测外泌体的适配体组，所述适配体组包括CD63适配体和EpCam适配体，所述CD63适配体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示，所述EpCam适配体如序列表中SEQIDNo.2所示。所述CD63适配体能特异性与外泌体表面表达的CD63蛋白结合，所述EpCam适配体能特异性与外泌体表面表达的EPCAM蛋白结合，所述适配体组，不易受pH、温度等环境因素影响稳定性好，同时适配体体积小，合成容易，大大降低制备的成本。同时本专利技术提供的一种检测外泌体的适配体组，通过与外泌体双重蛋白特异性结合，本专利技术提供的适配体组检测外泌体的可视检测浓度为5×105，具有较高的特异性。同时本专利技术提供的适配体组填补了现有技术中采用适配体检测外泌体的空白，为利用适配体检测外泌体的技术提供重要信息。本专利技术提供了侧流式适配体生物传感器，基于层析试纸条原理将能够特异性结合外泌体表面蛋白的纳米金标记的适配体喷涂于结合垫上，将上述方案中另一个适配体喷涂在检测垫的检测线上，质控线上喷涂有能与纳米金标记的适配体的DNA探针通过碱基互补配对结合。当样品中含有目标外泌体时，纳米金标记的适配体与外泌体结合形成复合物随着水流向上层析运动到达检测线，与检测线上的另一个适配体结合，同时未与外泌体结合的纳米金标记的适配体与质控线上的DNA探针结合，此时检测线和质控线变为红色。当样品中没有外泌体或外泌体的含量极低，只有质控线上显示红色，检测线上不显色。本专利技术提供的所述侧流式适配体生物传感器能够实现定性和定量检测。实现表明，本专利技术提供的测流式适配体生物传感器可以检测到500000个外泌体。同时在样品浓度为0～1×106浓度范围内，信号值与外泌体浓度呈线性关系，表明在该浓度范围内容，所述测流式适配体生物传感器的检测结果较为准确。同时本专利技术提供的侧流式适配体生物传本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测外泌体的CD63适配体，其特征在于，所述CD63适配体组的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测外泌体的CD63适配体，其特征在于，所述CD63适配体组的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。2.一种检测外泌体的适配体组，其特征在于，所述适配体组包括权利要求1所述的CD63适配体和EpCam适配体，所述EpCam适配体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。3.一种侧流式适配体生物传感器，包括底板和粘附在所述底板上由下向上依次连接的结合垫、检测垫和吸收垫，所述检测垫包括检测线和质控线，其特征在于，所述结合垫喷涂有纳米金标记的CD63适配体偶合物，所述检测线喷涂有链霉亲和素-生物素标记的EpCam适配体偶合物，所述质控线喷涂有链霉亲和素-生物素标记的DNA探针，DNA探针的核苷酸序列与CD63适配体的核苷酸序列的3′端序列互补；所述纳米金标记的CD63适配体偶合物中CD63适配体为权利要求1所述检测外泌体的CD63适配体；所述链霉亲和素-生物素标记的EpCam适配体偶合物中的EpCam适配体为权利利要求2所述的适配体组中的EpCam适配体。4.根据权利要求3所述的侧流式适配体生物传感器，其特征在于，所述链霉亲和素-生物素标记的DNA探针中DNA探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。5.根据权利要求3或4所述的侧流式适配体生物传感器，其特征在于，所述纳米金标记的CD63的喷涂体积为3μl/cm结合垫。6.根据权利要求3所述的侧流式适配体生物传感器，其特征在于，所述链霉亲和素-生物素标记的EpCam适配体偶合物的喷涂喷涂次数为3次，所述链霉亲和素-生物素标记的EpCam适配体偶合物的喷涂体积为3μl/cm检测垫。7.权利要求3～6任意一项所述侧流式适配体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在震荡条件下向纳米金溶液中依次加入dATP溶液、SDS溶液和NaCl溶液进行反应，得到的反应液和CD63适配体混合，在60℃下反应3h，固液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国东，邱万伟，刘文举，钱立生，张静，于庆才，李坤，
申请(专利权)人：安徽科技学院，
类型：发明
国别省市：安徽,34