The invention discloses a two-way thermal cycle subtraction SELEX rapid screening method and kit. The method organically combines nano (agar) magnetic beads material, SELEX technology and high throughput nucleic acid sequencing, and establishes a rapid and efficient nucleic acid aptamer screening technology system for (composite) target molecules and corresponding kits. The kit can quickly screen out the aptamers with high specificity and affinity. This method has the advantages of fast, high efficiency, low cost, simple operation and mechanization.
【技术实现步骤摘要】
双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法及试剂盒
本专利技术涉及一种核酸适配体的筛选方法，尤其是涉及一种将纳米磁珠材料、SELEX技术和高通量核酸测序有机结合，建立双向热循环消减SELEX快速筛选（复合）靶分子核酸适配体的方法；本专利技术同时还涉及一种双向热循环消减SELEX快速筛选（复合）靶分子核酸适配体的试剂盒。
技术介绍
SELEX技术，即指数富集的配基系统进化技术（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX），利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体（Aptamer）。自Tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过二十多年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具，被应用于生物化学、基因调控、疾病诊断及新药研发等领域。随着筛选的靶标越来越广泛，从最开始的有机染料和酶逐渐扩展到更小的离子、氨基酸、毒素以及更复杂的癌细胞、干细胞、临床组织切片、血清等，对于不同的靶物质，有必要采...
【技术保护点】
1.一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）靶磁珠制备：分别将捕捉磁珠与目标靶分子、消减靶分子混合，在37±0.3℃孵育30min分钟，洗涤缓冲液洗1次，形成磁珠‑目标靶、磁珠‑消减靶；再分别加入蛋白封闭液，37±0.3℃封闭1h小时后去上清，用洗涤缓冲液洗至无泡沫，分离磁珠中加入pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液，含0.1%的叠氮钠；（2）双向消减结合：将随机ssDNA库用结合缓冲液溶解，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却；正向结合：第一轮消减结合：将随机寡核苷酸文库先和磁珠‑消减靶复合物37℃结合1h...
【技术特征摘要】
1.一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）靶磁珠制备：分别将捕捉磁珠与目标靶分子、消减靶分子混合，在37±0.3℃孵育30min分钟，洗涤缓冲液洗1次，形成磁珠-目标靶、磁珠-消减靶；再分别加入蛋白封闭液，37±0.3℃封闭1h小时后去上清，用洗涤缓冲液洗至无泡沫，分离磁珠中加入pH值为7.4的1×Bindingbuffer缓冲液，含0.1%的叠氮钠；（2）双向消减结合：将随机ssDNA库用结合缓冲液溶解，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却；正向结合：第一轮消减结合：将随机寡核苷酸文库先和磁珠-消减靶复合物37℃结合1h，磁分离，吸出上清；将上清加入到磁珠-目标靶复合物中，37℃结合1h，用0.5mL洗涤缓冲液充分摇动，洗涤3次，去除未结合的非特异性分子；在磁珠中加入结合缓冲液，95℃加热5min，重复3次，混合吸出的上清，上清为第一轮次级文库；从第二轮开始，将次级文库先与磁珠-目标靶复合物结合，磁分离弃上清，用0.5mL洗涤缓冲液充分摇动，洗涤3次，去除未结合的非特异性分子；在结合目标靶的磁珠中，加入结合缓冲液，95℃加热5min，重复3次，混合吸出的上清，加入磁珠-消减靶复合物中，37℃结合1h，磁分离，吸出上清为次级文库；反向结合：将磁珠-消减靶复合物视为目标靶，磁珠-目标靶复合物为消减靶进行结合，结合过程同正向结合；（3）洗涤：用洗涤缓冲液充分摇动，洗涤3次，去除未结合的非特异性分子；（4）洗脱：加入洗脱缓冲液洗结合有靶分子的磁珠3次后，磁分离，在磁珠中加入1×PCRBuffer，95℃加热5分钟，磁分离，吸取上清，重复加热3次，收集上清混匀；（5）次级文库的制备：实时荧光定量-PCR对前轮筛选消减获得的ssDNA进行富集检测后，用不对称PCR方法和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶制备次级文库：以步骤（1）所述次级文库上清为模板DNA，PCR扩增16~20个循环后，得到第一轮筛选产物；再以筛选产物为模板，不对称PCR扩增20~30个循环，取PCR产物进行变性PAGE凝胶电泳，切取单链条带，粉碎，加入洗脱缓冲液300μL，95℃加热5min，3000r/min离心收集上清，重复3次；将上清加入3000Dr超滤管中，超滤20min，得到ssDNA次级文库；（6）循环筛选：重复步骤（1）-（5），筛选7~15轮，每轮用实时定量-PCR检测次级库对目标靶和消减靶的结合量，确定富集程度，制备适配体富集文库；（7）对适配体富集文库进行高...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖世奇，袁红霞，翟蒙，张蕾，田彩平，魏政丽，
申请(专利权)人：廖世奇，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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