一株贝莱斯芽孢杆菌及其分离方法与应用技术

本发明专利技术涉及一株生防贝莱斯芽孢杆菌及其分离方法与应用。所述贝莱斯芽孢杆菌株已于2018年7月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏名称为：芽孢杆菌504或Bacillus velezensis 504，保藏编号为CCTCC NO:M 2018493。本发明专利技术的贝莱斯芽孢杆菌对水稻白叶枯病菌具有显著的抑制效果，同时对水稻细菌性条斑病菌、香蕉细菌性枯萎病菌、辣椒斑点病菌、核桃细菌性黑斑病菌和豇豆枯萎病菌等也表现广谱的抑菌活性，具有重要的生防应用前景。

A strain of Bacillus beliae and its isolation method and Application

The invention relates to a strain of biocontrol Bacillus beliae and its separation method and application. The strain of Bacillus beliae has been preserved in the China Typical Culture Preservation Center on July 25, 2018. Its name is Bacillus 504 or Bacillus velezensis 504, and its storage number is CCTCC NO: M 2018493. The invention has significant inhibition effect on rice bacterial leaf blight fungus, and has broad-spectrum bacteriostatic activity on rice bacterial leaf spot fungus, banana bacterial Fusarium wilt fungus, pepper spot fungus, walnut bacterial black spot fungus and cowpea Fusarium wilt fungus, etc., which has important biocontrol application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一株贝莱斯芽孢杆菌及其分离方法与应用
本专利技术属于微生物技术应用领域，尤其是涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其分离方法与应用。
技术介绍
水稻白叶枯病(BacterialBlight，BB)和水稻细菌性条斑病(BacterialLeafStreak，BLS)是水稻生产中常见的重要细菌病害，分别是由水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)和水稻条斑病菌(X.oryzaepv.oryzicola，Xoc)引起的(邹丽芳，周丹，刘之洋，邹华松，陈功友.水稻黄单胞菌致病相关基因插入突变体系的建立[J].植物病理学报，2012，42(02):176-185.)。黄单胞菌的侵染和繁殖主要取决于在寄主组织内分泌的多糖、吸附素、Ⅲ型分泌系统和脂多糖等毒性因子(唐庆华，张世清，牛晓庆，朱辉，余凤玉，覃伟权.黄单胞菌毒性因子调控的研究进展[J].生物灾害科学，2012，35(02):134-141.)。水稻白叶枯病发病范围极广，已遍布全球各大水稻产区；水稻遭受白叶枯病害后，沿叶脉产生灰白色病斑，水稻产量一般减少20％～30％，严重时甚至绝收(翟文学,朱立煌.水稻白叶枯病抗性基因的研究与分子育种.中国生物工程杂志.1999)。水稻细菌性条斑病是水稻生产中一种重要的检疫性细菌病害，局部流行于中国南方及东南亚国家；水稻感染条斑病后，叶片上呈条斑症状，严重时水稻减产达40％～60％，其危害更甚于白叶枯病(张荣胜等，水稻细菌性条斑病研究进展,江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.)，2014，30(4)：901-908)。目前，生产上对这两种水稻病害的防治方法主要包括化学防治和农业防治。化学防治存在污染环境、危害人畜健康及容易造成病原菌突变而产生抗药性等弊端；农业防治又难以大规模推广。因此，利用有益微生物进行生物防治已成为农业生产中的一大趋势(宗英，赵月菊，刘阳，杨庆利.一株贝莱斯芽孢杆菌抑制禾谷镰刀菌的研究[J].核农学报，2018，32(02):310-317.)。芽孢杆菌作为生物防治研究领域的热点之一，能够通过分泌抗菌蛋白、脂肽类及聚酮类等抑菌物质而抑制植物病原菌的生长，从而更好的促进植物生长(桑建伟，杨扬，陈奕鹏，蔡吉苗，陆翠梅，黄贵修.内生解淀粉芽孢杆菌BEB17脂肽类和聚酮类化合物的抑菌活性分析[J].植物病理学报，2018，48(03):402-412.)。既保障了环境和人畜安全，又能够有效的防止病原菌产生抗性，同时满足了消费者对农产品产量、质量和安全性的多重要求。因此，芽孢杆菌在现代农业生产中有着极大的应用前景(陈志谊，刘永峰，刘邮洲，张荣胜.植物病害生防芽孢杆菌研究进展[J].江苏农业学报，2012，28(05):999-1006.)。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是芽孢杆菌属的一个新种，广泛分布于土壤、植物根际和内部、河流等各种生态环境(蔡高磊，张凡，欧阳友香，赵昌松，彭宣和，江爱明.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)研究进展[J].北方园艺，2018(12):162-167.)。作为生防芽孢杆菌，同样具有促进植物生长和抵御病原微生物的作用，具有广谱的抗菌活性，可用作农业生产上的生物防治调节剂。贝莱斯芽孢杆菌抑制植物病原菌生长的机理主要包括：产生抗菌蛋白和脂肽类抗生素，以非核糖体多肽合成酶和聚酮化合物合成抗生素及诱导植物产生系统抗性；通过产生IAA、NH3和ACC脱氨酶来促进植物生长。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其分离方法与应用。本专利技术的贝莱斯芽孢杆菌对水稻白叶枯病菌具有显著的拮抗作用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术的第一方面是：提供一株贝莱斯芽孢杆菌，分离自福建省三明市尤溪县空心菜田土壤，命名为芽孢杆菌504或Bacillusvelezensis504，所述贝莱斯芽孢杆菌株已于2018年7月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2018493。保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心。通过固体培养基平板培养，观察所述贝莱斯芽孢杆菌的菌落颜色为乳白色，边缘不光滑，不规则，表面干燥粗糙，不透明；通过显微镜观察，该菌株的菌体为短杆状，可产生芽孢。通过生理生化测试，明确所述贝莱斯芽孢杆菌是一株革兰氏阳性细菌，具有产生H2S的能力；能够分泌明胶酶，不能水解β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酶脱羧酶、色氨酸脱氨酶及脲酶；能够利用3-羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇，不能产生吲哚；能够氧化蔗糖，不能氧化葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、密二糖和苦杏仁苷。能够利用甘油、葡萄糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇等17种碳源。所述水稻黄单胞菌包括水稻条斑病菌Xoc和水稻白叶枯病菌Xoo两个致病变种。通过平板对峙培养方法，检测贝莱斯芽孢杆菌504对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的拮抗作用，证明其对2类病原菌均表现广谱的拮抗活性。进一步，检测了该贝莱斯芽孢杆菌对另外9种病原黄单胞菌的拮抗作用，证明其对香蕉细菌性枯萎病菌、辣椒斑点病菌、核桃细菌性黑斑病菌和豇豆枯萎病菌等9株植物病原菌也具有拮抗活性。本专利技术的第二方面是：提供所述贝莱斯芽孢杆菌的分离方法：采用梯度稀释涂板法，将土样加无菌水溶解震荡15min，依次稀释成不同梯度的土壤菌悬液，分别涂布于已接种水稻条斑病菌的NA平板上，观察是否有抑菌圈产生，将能产生明显抑菌圈的菌落在NA平板上划线得到单菌落，利用细菌16SrRNA基因和gyrA基因进行PCR扩增，并构建系统进化树，明确该菌株的分类地位。本专利技术使用16SrRNA基因和gyrA基因分别构建系统进化树，进行亲缘关系的比较分析，并结合菌株的生理生化特征，证明该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。其中，16SrRNA基因的序列如SEQIDNO.1所示，gyrA基因的序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第三方面是：提供所述芽孢杆菌的应用，包括以下应用：在本专利技术的一个具体实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌504对水稻条斑病菌Xoc和水稻白叶枯病菌Xoo均具有广谱的拮抗作用。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌504对水稻白叶枯病菌具有显著的拮抗作用。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述水稻白叶枯病菌包括8569、YC2、AH1、YC6、YC11、YN04-1、LYG46、JL3、PXO99A、YC18、XZ35、YC7。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌504对水稻条斑病菌具有拮抗作用。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述水稻条斑病菌包括HNB07-3、RS105、RS85、HNB3-17、HANB12-26、ZJB01-25、HANB1-19、JSB1-39、AHB3-7、HNB8-47、AHB1-58、YNB01-3。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌504对多种黄单胞属的其他植物病原细菌，包括香蕉细菌性枯萎病菌(X.campestrispv.musacearum)、辣椒斑点病菌(X.campestrispv本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌株已于2018年7月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2018493。

【技术特征摘要】
1.一株贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌株已于2018年7月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2018493。2.根据权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌菌落为乳白色，边缘不光滑，不规则，表面干燥粗糙，不透明；菌体为短杆状，可产生芽孢。3.根据权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，短杆状，能产生芽孢，需氧或兼性厌氧细菌；具有产生H2S的能力；能够分泌明胶酶，不能水解β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酶脱羧酶、色氨酸脱氨酶及脲酶；能够利用3-羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇，不能产生吲哚；能够氧化蔗糖，不能氧化葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、密二糖和苦杏仁苷，能够利用包括甘油、葡萄糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇在内的碳源。4.根据权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌对水稻黄单胞菌具有拮抗作用。5.根据权利要求4所述贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述水稻黄单胞菌包括水稻条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,X...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，邹丽芳，杨瑞环，李生樟，刘昭，张翠萍，陈功友，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31