一种生产乳酸和3-羟基丁酸共聚酯的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种生产乳酸和3‑羟基丁酸共聚酯的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术公开的生产乳酸和3‑羟基丁酸共聚酯的基因工程菌通过如下步骤获得：敲除受体菌的poxB基因、pflB基因和aceEF基因；增加受体菌中phaA基因、phaB基因、phaC基因和pct基因编码蛋白质的含量。本发明专利技术的工程菌株能够同时利用葡萄糖和乙酸合成乳酸和3‑羟基丁酸共聚酯，并且重组菌在摇瓶培养中的聚合物产量能达到较高的水平，乳酸和3‑羟基丁酸单体的比例可以通过改变葡萄糖和乙酸的浓度进行控制，具有较好的应用前景。

A Genetically Engineered Bacterium Producing Lactic Acid and 3-Hydroxybutyric Acid Copolyester and Its Construction Method and Application

The invention discloses a genetic engineering bacteria for producing lactic acid and 3 hydroxybutyric acid copolyester, a construction method and application thereof. The genetic engineering bacteria producing lactic acid and 3 hydroxybutyric acid copolyester disclosed in the present invention are obtained by knocking out the poxB gene, pflB gene and aceEF gene of the acceptor bacteria, and increasing the content of the protein encoded by phaA gene, phaB gene, phaC gene and PCT gene in the acceptor bacteria. The engineering strain of the invention can simultaneously synthesize lactic acid and 3 hydroxybutyric acid copolyester by using glucose and acetic acid, and the polymer yield of the recombinant strain can reach a higher level in shake flask culture. The ratio of lactic acid and 3 hydroxybutyric acid monomer can be controlled by changing the concentration of glucose and acetic acid, thus having a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种生产乳酸和3-羟基丁酸共聚酯的基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术属于生物技术、基因工程和发酵工程领域，涉及一种生产乳酸和3-羟基丁酸共聚酯的基因工程菌及其构建方法和应用，更具体地，涉及一种利用葡萄糖和乙酸为碳源生产乳酸和3-羟基丁酸共聚酯的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
乙酸，也叫醋酸、冰醋酸，为食醋主要成分，也是一种常见的化工产品。工业上主要通过乙醛氧化法、液态烃液相氧化法、甲醇羰基合成法等化学合成的手段生产乙酸。近年来，乙酸市场持续低迷，如果能开发乙酸的下游产品，延伸产业链，将会促进乙酸产业发展。把乙酸用作微生物发酵的碳源，具有较好的应用前景，已有一些文献报道。葡萄糖是自然界中分布最广泛、含量最多的一种单糖，从微生物到高等动物包括人类等都能够利用葡萄糖作为营养物质。葡萄糖是目前发酵工业中最主要的碳源，由此消耗了大量的淀粉等粮食资源。自然界中存在大量的非粮食来源的木质纤维素资源，其主要的分解产物有葡萄糖和木糖等。由于碳分解代谢物阻遏效应，在葡萄糖和木糖同时存在的条件下，多数微生物优先选择利用葡萄糖，待葡萄糖耗尽之后才开始利用木糖生长。在葡萄糖和乙酸混合物中，部分微生物例如谷氨酸棒杆菌能够同时利用葡萄糖和乙酸生长，但是大肠杆菌等优先选择利用葡萄糖，葡萄糖耗尽后，才能利用乙酸生长。敲除大肠杆菌的葡萄糖磷酸转移酶系统(glucosephosphotransferasesystem,PTS)，可以解除碳分解代谢物阻遏效应，实现葡萄糖和乙酸的共利用，但是PTS缺失降低了细菌的生长速度。聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物在生长代谢不平衡条件下利用葡萄糖或者脂肪酸等碳源在细胞内合成的高分子聚合物。在环境中的碳源匮乏时，细胞内积累的PHA能够被微生物分解利用。PHA具有生物可降解性和与石油来源的塑料等相似的材料学性质，可以用作环境友好型的包装材料和组织工程材料。过去几十年，PHA的生产研究和应用开发引起了科学界和工业界的广发关注。迄今为止，已有数种PHA产品进行了商业化的试生产。从结构上讲，PHA是由羟基脂肪酸单体聚合而成的，自然界中最常见的单体是3-羟基脂肪酸。2008年，日本科学家Taguchi等实现了乳酸(2-羟基丙酸)的微生物法聚合，利用大肠杆菌合成出乳酸和3-羟基丁酸共聚酯(P(LA-co-3HB))。在构建的组合代谢路径中，葡萄糖是合成乳酸和3-羟基丁酸共聚酯的碳源。葡萄糖通过糖酵解途径之后生成丙酮酸，一部分丙酮酸由乳酸脱氢酶催化生成乳酸，进而生成乳酰辅酶A被聚羟基脂肪酸酯合成酶聚合，另一部分丙酮酸转化为乙酰辅酶A,之后生成3-羟基丁酰辅酶A被聚羟基脂肪酸酯合成酶聚合。所得重组大肠杆菌合成的共聚酯中，乳酸单体含量为6mol％。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何利用葡萄糖和乙酸两种碳源合成乳酸和3-羟基丁酸共聚酯并对其单体比例进行调控。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了重组菌的构建方法，所述方法包括对受体菌进行下述A1-A7的改造，得到所述重组菌；A1、敲除所述受体菌的丙酮酸氧化酶基因(poxB基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：946132)或抑制所述poxB基因的表达或抑制所述poxB基因编码的蛋白质的活性；A2、敲除所述受体菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：945514)或抑制所述pflB基因的表达或抑制所述pflB基因编码的蛋白质的活性；A3、敲除所述受体菌的丙酮酸脱氢酶基因(aceE基因和aceF基因，记为aceEF基因；aceE基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：944834；aceF基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：944794)或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；A4、增加所述受体菌中β-酮硫解酶基因(phaA基因)编码蛋白质的含量或增强所述phaA基因编码蛋白质的活性；A5、增加所述受体菌中乙酰乙酰辅酶A还原酶基因(phaB基因)编码蛋白质的含量或增强所述phaB基因编码蛋白质的活性；A6、增加所述受体菌中聚羟基脂肪酸酯合成酶基因(phaC基因)编码蛋白质的含量或增强所述phaC基因编码蛋白质的活性；A7、增加所述受体菌中丙酰辅酶A转移酶基因(pct基因)编码蛋白质的含量或增强所述pct基因编码蛋白质的活性；所述受体菌为含有所述poxB基因、所述pflB基因和所述aceEF基因的细菌或真菌。上述方法中，所述受体菌为1)或2)或3)：1)大肠杆菌；2)大肠杆菌MG1655；3)大肠杆菌JM109。上述方法中，所述phaA基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：a1)序列表中序列8所示的蛋白质；a2)将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述phaB基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质：b1)序列表中序列9所示的蛋白质；b2)将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述phaC基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质：c1)序列表中序列10所示的蛋白质；c2)将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述pct基因编码蛋白质为下述d1)或d2)的蛋白质：d1)序列表中序列11所示的蛋白质；d2)将序列表中序列11的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。上述方法中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述方法中，A1通过向所述受体菌中导入含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A2通过向所述受体菌中导入含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A4通过向所述受体菌中导入含有所述phaA基因的phaA基因表达盒实现；和/或，A5通过向所述受体菌中导入含有所述phaB基因的phaB基因表达盒实现；和/或，A6通过向所述受体菌中导入含有所述phaC基因的phaC基因表达盒实现；和/或，A7通过向所述受体菌中导入含有所述pct基因的pct基因表达盒实现。向所述受体菌中导入各表达盒均可通过将含有相应表达盒的表达载体导入所述受体菌中实现。所述表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为质粒pUC19。上述方法中，各基因的敲除均可通过λ-red同源重组方式实现。上述方法中，所述含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列6所示的DNA分子；所述含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA分子；所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列5所示的DNA分子；和/或，所述phaA基因表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组菌的构建方法，包括对受体菌进行下述A1‑A7的改造，得到所述重组菌；A1、敲除所述受体菌的poxB基因或抑制所述poxB基因的表达或抑制所述poxB基因编码的蛋白质的活性；A2、敲除所述受体菌的pflB基因或抑制所述pflB基因的表达或抑制所述pflB基因编码的蛋白质的活性；A3、敲除所述受体菌的aceEF基因或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；A4、增加所述受体菌中phaA基因编码蛋白质的含量或增强所述phaA基因编码蛋白质的活性；A5、增加所述受体菌中phaB基因编码蛋白质的含量或增强所述phaB基因编码蛋白质的活性；A6、增加所述受体菌中phaC基因编码蛋白质的含量或增强所述phaC基因编码蛋白质的活性；A7、增加所述受体菌中pct基因编码蛋白质的含量或增强所述pct基因编码蛋白质的活性；所述受体菌为含有所述poxB基因、所述pflB基因和所述aceEF基因的细菌或真菌。

【技术特征摘要】
1.重组菌的构建方法，包括对受体菌进行下述A1-A7的改造，得到所述重组菌；A1、敲除所述受体菌的poxB基因或抑制所述poxB基因的表达或抑制所述poxB基因编码的蛋白质的活性；A2、敲除所述受体菌的pflB基因或抑制所述pflB基因的表达或抑制所述pflB基因编码的蛋白质的活性；A3、敲除所述受体菌的aceEF基因或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；A4、增加所述受体菌中phaA基因编码蛋白质的含量或增强所述phaA基因编码蛋白质的活性；A5、增加所述受体菌中phaB基因编码蛋白质的含量或增强所述phaB基因编码蛋白质的活性；A6、增加所述受体菌中phaC基因编码蛋白质的含量或增强所述phaC基因编码蛋白质的活性；A7、增加所述受体菌中pct基因编码蛋白质的含量或增强所述pct基因编码蛋白质的活性；所述受体菌为含有所述poxB基因、所述pflB基因和所述aceEF基因的细菌或真菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体菌为1)或2)或3)：1)大肠杆菌；2)大肠杆菌MG1655；3)大肠杆菌JM109。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述phaA基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：a1)序列表中序列8所示的蛋白质；a2)将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述phaB基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质：b1)序列表中序列9所示的蛋白质；b2)将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述phaC基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质：c1)序列表中序列10所示的蛋白质；c2)将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述pct基因编码蛋白质为下述d1)或d2)的蛋白质：d1)序列表中序列11所示的蛋白质；d2)将序列表中序列11的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：A1通过向所述受体菌中导入含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A2通过向所述受体菌中导入含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A4通过向所述受体菌中导入含有所述phaA基因的phaA基因表达盒实现；和/或，A5通过向所述受体菌中导入含有所述phaB基因的phaB基因表达盒实现；和/或，A6通过向所述受体菌中导入含有所述phaC基因的phaC基因表达盒实现；和/或，A7通过向所述受体菌中导入含有所述pct基因的pct基因表达盒实现。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李正军，史理陇，笪央央，普楠，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11