一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的配制制造技术

技术编号:20264245 阅读:33 留言:0更新日期:2019-02-02 00:57
本发明专利技术公开了一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的配制,包括如下步骤:(1)改性复合粉的制备;(2)原料称取;(3)培养基的配制;(4)培养基灭菌。本发明专利技术最终配制的培养基营养搭配合理,添加的改性复合粉,有助于改善培养基的营养配制,释放负离子,促进菌体的生长,增加活菌数,提高单位体积质粒总含量,单位菌体质粒含量,单位质量质粒中超螺旋质粒的含量,并且对于质粒的纯度有很好的改善作用,极具市场推广价值。

A Culture Medium for High Efficient Expression of Plasmid DNA in Escherichia coli Engineering Bacteria

The invention discloses a preparation of a culture medium for efficient expression of plasmid DNA of E. coli engineering bacteria, which comprises the following steps: (1) preparation of modified composite powder; (2) weighing of raw materials; (3) preparation of culture medium; (4) sterilization of culture medium. The improved composite powder added in the final culture medium of the invention has reasonable nutritional matching and can help improve the nutritional formulation of the culture medium, release negative ions, promote the growth of bacteria, increase the number of live bacteria, increase the total content of plasmids per unit volume, the content of plasmids per unit volume, the content of superhelix plasmids per unit mass plasmid, and has a good improvement effect on the purity of plasmids. It has great market promotion value.

【技术实现步骤摘要】
一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的配制
本专利技术属于生物制剂
,具体涉及一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的配制。
技术介绍
质粒具有自主复制能力,使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段,送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中,构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术,转入受体细胞(大肠杆菌)中,使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达,从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。研究发现,提取的质粒一般有超螺旋、线形和开环三种构象。进行琼脂糖凝胶电泳实验时三种构象的质粒电泳速度为超螺旋质粒>线形质粒>开环质粒,以超螺旋质粒电泳速度最快,线形质粒在中间,而开环质粒在最后。更重要的是,在用质粒转染时,超螺旋比例高时其转染效率及表达量较高,普遍认为超螺旋质粒DNA在基因治疗和DNA疫苗中是起主要作用的质粒载体形式。细菌的培养作为生产超螺旋质粒DNA的第一步,在整个生产过程中起着关键的作用。它兴驻直接影响到超螺旋质粒DNA的产量,而且也影响下续步骤的进行。因此,选择和优化菌体的生长条件,是产生大量稳定的超螺旋质粒DNA必要条件,特别是培养基的组成成分和浓度对细菌的生长和超螺旋质粒DNA的含量有较大的影响。《一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基》(申请号为200910213725.8)中公开了一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基,在优化培养基的基础上和在非细菌菌体增殖的最适条件下,通过减少RNA和蛋白质的合成,从而将营养底物趋向于转化成质粒,最终提高范围菌体质粒的拷贝数,而对于超螺旋质粒的含量没有起到提高作用。《用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基及培养方法》(申请号为201610877655.6)中公开了一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基及培养方法,能够显著提高单位体积质粒总含量和单位菌体质粒含量,但是单位菌体质粒含量依然有待提高,并且对于单位质量质粒中超螺旋质粒的含量没有显著的改善。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的问题,提供了一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的配制。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的配制,包括如下步骤:(1)改性复合粉的制备:a.将黄土石和碳酸镧按照重量比为2~3:1共同投入碱液中进行浸泡,浸泡时碱液内的温度控制为60~70℃,浸泡处理20~30min后滤出;b.将操作a中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入酸液中进行浸泡,浸泡时酸液内的温度控制为50~56℃,浸泡处理16~18min后滤出;c.将操作b中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理,煅烧炉内的温度控制为920~980℃,煅烧处理5~7min后,将煅烧炉中的温度降至102~104℃,然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡,浸泡过程在微波炉中进行,浸泡处理12~18min后,过滤得滤渣;d.将操作c所得的滤渣置于烘箱内进行干燥,烘箱内的温度控制为65~75℃,干燥至含水率为6~8%即得改性复合粉;(2)原料称取:称取相应重量份的甘油20~24份、胰蛋白胨12~16份、酵母提取物13~15份、氯化钠12~14份、微量元素0.6~0.7份、步骤(1)所得改性复合粉8~10份、无菌水450~550份备用;(3)培养基的配制:将步骤(2)称取的无菌水注入搅拌罐内,将搅拌罐内的温度升至98~102℃,然后将步骤(2)中称取的甘油、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、微量元素、步骤(1)所得改性复合粉依次投入搅拌罐内,边搅拌边投入,持续搅拌50~60min,搅拌的同时进行超声波处理;(4)培养基灭菌:将步骤(3)中搅拌混匀的混合液置于高温高压锅内进行灭菌处理,灭菌的温度为119~123℃,灭菌的时间为18~24min,灭菌结束后,取出混合液即得培养基。进一步的,所述步骤(1)操作a中碱液为8~10%的氢氧化钠溶液。进一步的,所述步骤(1)操作b中酸液为13~14%的盐酸溶液。进一步的,所述步骤(1)操作c中改性液各成分及其对应重量份为:十二烷基苯磺酸钠12~13份、硬脂酸钙8~10份、水解酪蛋白6~8份、异戊醇7~9份、无菌水300~320份。进一步的,所述步骤(1)操作c中微波炉中的频率控制为87~91GHz。进一步的,所述步骤(2)或步骤(3)中微量元素各成分及对应重量份为:硫酸铜0.002~0.003份、硫酸锰0.00012~0.00016份、碘化钾0.0023~0.0025份、硫酸锰0.00001~0.00002份、氯化钴0.00013~0.00015份、硫酸锌0.002~0.003份。进一步的,所述步骤(3)中超声波的频率为42~46kHz。本专利技术在现有的大肠杆菌工程菌培养基配制的基础上进行了很大程度的改善,其中添加了一种特殊的改性复合粉,其是以黄土石和碳酸镧合理搭配作为主体物质改性配制,在改性复合粉的制备过程中,首先将黄土石和碳酸镧按照一定的比例共同投入碱液中进行浸泡,浸泡一段时间后滤出,再投入酸液中进行浸泡,碱酸处理后,黄土石和碳酸镧粉末表面遭受一定程度的侵蚀,为后续的改性处理奠定一定的基础,酸碱浸泡过程中,有助于黄土石和碳酸镧的相互结合,再将酸碱浸泡处理后的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧,黄土石和碳酸镧的表面进一步被软化,在高温条件下煅烧,表面形成多孔结构,有助于提高培养基的透气性,促进菌体的生长,防止菌体死亡,提高菌液的质量;煅烧后将煅烧炉中的温度降至102~104℃,然后取出黄土石和碳酸镧混合物立刻置于改性液中进行浸泡,快速降温,黄土石和碳酸镧混合物快速吸附改性液中的活性成分,经过改性液改性处理,黄土石和碳酸镧混合物的表面活性增加,促进菌体对培养基中营养成分的吸收,并且有助于超螺旋质粒DNA处于拓扑缠绕状态,在菌液提取中,更容易沉淀,进而提高单位质量质量中超螺旋质粒DNA的比重,改性处理的过程在微波环境中实施,微波辅助,增强改性的效果。本专利技术相比现有技术具有以下优点:本专利技术最终配制的培养基营养搭配合理,添加的改性复合粉,有助于改善培养基的营养配制,释放负离子,促进菌体的生长,增加活菌数,提高单位体积质粒总含量,单位菌体质粒含量,单位质量质粒中超螺旋质粒的含量,并且对于质粒的纯度有很好的改善作用,极具市场推广价值。具体实施方式实施例1一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的配制,包括如下步骤:(1)改性复合粉的制备:a.将黄土石和碳酸镧按照重量比为2:1共同投入碱液中进行浸泡,浸泡时碱液内的温度控制为60℃,浸泡处理20min后滤出;b.将操作a中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入酸液中进行浸泡,浸泡时酸液内的温度控制为50℃,浸泡处理16min后滤出;c.将操作b中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理,煅烧炉内的温度控制为920℃,煅烧处理5min后,将煅烧炉中的温度降至102℃,然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡,浸泡过程在微波炉中进行,浸泡处理12min后,过滤得滤渣;本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的配制,其特征在于,包括如下步骤:(1)改性复合粉的制备:a. 将黄土石和碳酸镧按照重量比为2~3:1共同投入碱液中进行浸泡,浸泡时碱液内的温度控制为60~70℃,浸泡处理20~30min后滤出;b. 将操作a中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入酸液中进行浸泡,浸泡时酸液内的温度控制为50~56℃,浸泡处理16~18min后滤出;c. 将操作b中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理,煅烧炉内的温度控制为920~980℃,煅烧处理5~7min后,将煅烧炉中的温度降至102~104℃,然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡,浸泡过程在微波炉中进行,浸泡处理12~18min后,过滤得滤渣;d. 将操作c所得的滤渣置于烘箱内进行干燥,烘箱内的温度控制为65~75℃,干燥至含水率为6~8%即得改性复合粉;(2)原料称取:称取相应重量份的甘油20~24份、胰蛋白胨12~16份、酵母提取物13~15份、氯化钠12~14份、微量元素0.6~0.7份、步骤(1)所得改性复合粉8~10份、无菌水450~550份备用;(3)培养基的配制:将步骤(2)称取的无菌水注入搅拌罐内,将搅拌罐内的温度升至98~102℃,然后将步骤(2)中称取的甘油、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、微量元素、步骤(1)所得改性复合粉依次投入搅拌罐内,边搅拌边投入,持续搅拌50~60min,搅拌的同时进行超声波处理;(4)培养基灭菌:将步骤(3)中搅拌混匀的混合液置于高温高压锅内进行灭菌处理,灭菌的温度为119~123℃,灭菌的时间为18~24min,灭菌结束后,取出混合液即得培养基。...

【技术特征摘要】
1.一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的配制,其特征在于,包括如下步骤:(1)改性复合粉的制备:a.将黄土石和碳酸镧按照重量比为2~3:1共同投入碱液中进行浸泡,浸泡时碱液内的温度控制为60~70℃,浸泡处理20~30min后滤出;b.将操作a中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入酸液中进行浸泡,浸泡时酸液内的温度控制为50~56℃,浸泡处理16~18min后滤出;c.将操作b中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理,煅烧炉内的温度控制为920~980℃,煅烧处理5~7min后,将煅烧炉中的温度降至102~104℃,然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡,浸泡过程在微波炉中进行,浸泡处理12~18min后,过滤得滤渣;d.将操作c所得的滤渣置于烘箱内进行干燥,烘箱内的温度控制为65~75℃,干燥至含水率为6~8%即得改性复合粉;(2)原料称取:称取相应重量份的甘油20~24份、胰蛋白胨12~16份、酵母提取物13~15份、氯化钠12~14份、微量元素0.6~0.7份、步骤(1)所得改性复合粉8~10份、无菌水450~550份备用;(3)培养基的配制:将步骤(2)称取的无菌水注入搅拌罐内,将搅拌罐内的温度升至98~102℃,然后将步骤(2)中称取的甘油、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、微量元素、步骤(1)所得改性复合粉依次投入搅拌罐内,边搅拌边投入,持续搅拌50~60min,搅拌的同时进行超声波处理;(4)培养基灭菌:将步骤(3)中搅拌混匀的混合液置于高温高压锅内...

【专利技术属性】
技术研发人员:赵建阳王世凯韦小艳
申请(专利权)人:安徽欣伯玉生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:安徽,34

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