一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法。本发明专利技术所采用的发酵培养基包括以下组分：玉米粉、豆粕粉、麸皮、蔗糖、碳酸钙、磷酸二氢钾和氯化钠。本发明专利技术将杰米拉类芽孢杆菌活化后，经一级、二级种子液制备和发酵培养，当发酵液中90％以上菌体转化为芽孢时，停止发酵，发酵过程中采用了两步发酵技术，第一步目的使得菌体在短时间内大量增殖，第二步营造不适于菌体生长的环境，促进活菌向芽孢的转变，提高芽孢生成率，在50L发酵罐规模条件下，有效活菌数达7.5×10

A High Density Fermentation Method of Bacillus Jamila

The invention discloses a high-density fermentation method of Bacillus Jamila. The fermentation medium adopted by the invention comprises the following components: corn flour, soybean meal powder, bran, sucrose, calcium carbonate, potassium dihydrogen phosphate and sodium chloride. The invention activates Bacillus Jamila and prepares and ferments the primary and secondary seed liquor. When more than 90% of the bacteria in the fermentation liquor are transformed into spores, the fermentation stops and two-step fermentation technology is adopted in the fermentation process. The first step is to make the bacteria proliferate in a large amount in a short time. The second step is to create an environment not suitable for the growth of bacteria and promote the transformation of living bacteria into spores. Under the condition of 50L fermentor, the number of viable bacteria reached 7.5 x 10.

【技术实现步骤摘要】
一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法
本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法。
技术介绍
植物病虫害一直是农业生产的大敌，严重影响着农作物的生长，制约着农业的持续发展，造成了巨大的经济损失，因此关于植物病害防治的研究越来越受到重视。目前我国主要以化学农药防治为主，长期大量施用对生态环境和我们人类都造成严重危害。随着生物防治植物病害研究的深入，这种绿色、对环境友好、人畜无害、可降低化学农药的使用的防治方法，得到社会越来越多的关注和认可，成为近年来研究植物病害防治的热点，其中拮抗细菌在生物防治中发挥着重要作用。目前在拮抗细菌中研究最多的是芽孢杆菌，芽孢杆菌以其种类繁多、环境友好、易定植于植物根际表面等诸多优点，其产生的多种抗菌活性物质如脂肽类抗生素、抗菌蛋白或多肽类化合物对大多植物病原真菌都表现出很强的抑菌活性，且芽孢杆菌内生芽孢，抗逆性强，繁殖速度快，有利于工业化生产。利用微生物防治植物病害具有广阔的应用前景。杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillusjamilae)是芽孢杆菌属的一种，杰米拉类芽孢杆菌能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶或多肽等活性物质，对植物病原细菌、真菌有很好的抑制作用，显著提高植物的抗病性，同时能促使植物生长，提高植物产量，是一种很好的生防促生菌。本专利技术申请人从深海沉积物中分离获得一株杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillusjamilae)ZDC-04，保藏号为CGMCCNo.16231。经试验证明该菌株对由胶孢炭疽菌引起的果树(柑橘、苹果、葡萄)炭疽病和由尖孢镰刀菌引起的蔬菜枯萎病均具有良好的防治效果。微生物菌剂绝大部分以活菌作用，有效的活菌数是其重要的质量指标，菌剂中必须含有一定量的活菌数才能达到作用。我国对各种批准生产的菌剂都有明确的有效活菌数量和用量的规定。活菌数与芽孢得率是衡量杰米拉类芽孢杆菌菌剂的重要指标，但目前国内外很少对生防杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵优化的研究，且高密度发酵工艺优化中多数只提高活菌数，而芽孢形成数并不高，芽孢数低将导致菌剂的活性和质量不稳定，保存时间大幅降低，不适合实际使用防病。因此，开发一种既具有生防功能，又高芽孢数的菌剂产品对于实际的应用具有非常大的意义。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法。本专利技术使用廉价易得的的农副产品作为碳、氮源液体发酵生产杰米拉类芽孢杆菌，降低其生产成本，提高单位体积发酵液中的活菌数和芽孢得率，为杰米拉类芽孢杆菌的工业化生产以及推广提供参考。本专利技术首先提供了一种杰米拉类芽孢杆菌的发酵培养基，包括以下组分：玉米粉、豆粕粉、麸皮、蔗糖、碳酸钙、磷酸二氢钾和氯化钠。本专利技术所使用的杰米拉类芽孢杆菌为杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillusjamilae)ZDC-04。优选的，本专利技术的发酵培养基组成为：玉米粉12-30g/L，豆粕粉5-17g/L，麸皮5-14g/L，蔗糖6-12g/L，碳酸钙1-5g/L，磷酸二氢钾1-6g/L，氯化钠0-5g/L、初始pH值为6.4-7.4。更优选的，本专利技术的发酵培养基组成为：玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，麸皮8g/L，蔗糖6g/L，碳酸钙5g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠2g/L、初始pH值为6.4-7.4。所述的豆粕粉为粉碎后的豆粕，所述的麸皮为小麦粉碎后的麸皮，所述的氯化钠为工业氯化钠，其中蔗糖为一级白砂糖。本专利技术提供了上述发酵培养基在发酵杰米拉类芽孢杆菌中的应用。本专利技术还提供了一种杰米拉类芽孢杆菌的高密度发酵方法，其特征是，将杰米拉类芽孢杆菌活化后，经一级、二级种子液制备和发酵培养，当发酵液中90％以上菌体转化为芽孢时，停止发酵；具体包括以下步骤：(1)摇瓶一级种子液制备：将活化后的杰米拉类芽孢杆菌转入摇瓶种子培养基，在温度为28-37℃、摇床转速为160-200r/min下培养16-30h；所述摇瓶种子培养基组成为：蛋白胨10±2g/L、酵母提取物10±2g/L、蔗糖30±5g/L，pH6.5±0.1。(2)种子罐二级种子液制备：将培养好的摇瓶种子液按接种量1-5％(体积比)转接入二级种子培养基中，于温度30±2℃下培养14-18h；所述二级种子培养基组成为：玉米粉20±5g/L、豆粕粉15±3g/L、蔗糖30±5g/L、磷酸二氢钾5±1g/L，pH6.5±0.1。(3)将步骤(2)中所得的种子液按3-10％(体积比)的接种量接入装有上述发酵培养基的发酵罐中，于30±2℃发酵培养，当发酵液中90％以上菌体转化为芽孢时，停止发酵。优选的，所述步骤(2)的搅拌转速300-400r/min、装液量50-70％，通气量0.4-1m3/h，罐压0.03-0.05Mpa。所述的，所述步骤(3)发酵培养时，0-10h，发酵条件为：搅拌转速300-400r/min、通气量2-4m3/h，罐压0.03-0.05Mpa；11h之后的发酵培养条件为：搅拌转速200-300r/min、通气量1-2.5m3/h，罐压0.03-0.05Mpa。进一步的，所述活化杰米拉类芽孢杆菌菌种方法：将沙土管保存的杰米拉类芽孢杆菌划线接种于LB培养基平板上进行培养，28-37℃下培养16-48h，然后挑取单菌落划线转接于LB斜面培养基，28-37℃下培养16-48h后得活化菌种；所述的LB平板培养基与LB斜面培养基的组成为：蛋白胨100g/L，氯化钠100g/L，酵母提取物50g/L，琼脂15-20g/L、pH6.5±0.1。本专利技术在杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵工艺中，根据摇瓶一级种子、二级种子和发酵罐发酵情况的不同，分别配制了不同的培养基以提高种子活力促进高密度发酵。此外，在发酵培养过程中采用了两步发酵技术，第一步目的使得菌体在短时间内大量增殖，第二步营造不适于菌体生长的环境，促进活菌向芽孢的转变，提高芽孢生成率，从而使活菌数与芽孢得率都能得到提高。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1)本专利技术首次研究了杰米拉类芽孢杆菌的高密度发酵工艺，为杰米拉类芽孢杆菌的工业化生产以及推广提供参考；2)本专利技术发酵培养基的原料主要来自廉价易得的农副产品玉米粉、豆粕粉、麸皮，成本低，易于扩大生产；3)本专利技术发酵工艺简单，发酵周期短(15h)，有效活菌数和芽孢得率高，在50L发酵罐规模条件下，有效活菌数达7.5×109cfu/mL以上，产芽孢率达92.6％以上。具体实施方式实施例1：杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的分离与筛选(1)杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的分离方法本专利技术的杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04分离于东海海底沉积物(120.6°E，34°N)，水深17米，采用稀释涂布法分离获得，具体方法为：称取10g海底沉积物样品溶于90mL无菌水中，置于摇床中振荡30min，使样品与水充分混合，即获得10-1稀释液。取1ml上述稀释液至9ml无菌水中，摇匀即获得10-2稀释液。相同的方法得到10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。分别取10-4、10-5、10-6的稀释液100μL于倒好的LB平板中，用涂布器将稀释液涂布均匀，每个浓度重复3次。置于30℃的恒温箱中培养48h，挑取培养特征相异的单菌落进行平皿划线纯化，并分别编号保存。(2)胶孢炭疽菌和尖孢镰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杰米拉类芽孢杆菌的发酵培养基，包括以下组分：玉米粉、豆粕粉、麸皮、蔗糖、碳酸钙和磷酸二氢钾。

【技术特征摘要】
1.一种杰米拉类芽孢杆菌的发酵培养基，包括以下组分：玉米粉、豆粕粉、麸皮、蔗糖、碳酸钙和磷酸二氢钾。2.如权利要求1所述的一种杰米拉类芽孢杆菌的发酵培养基，其特征是，所述发酵培养基为：玉米粉12-30g/L，豆粕粉5-17g/L，麸皮5-14g/L，蔗糖6-12g/L，碳酸钙1-5g/L，磷酸二氢钾1-6g/L，氯化钠0-5g/L，初始pH值为6.4-7.4。3.如权利要求2所述的一种杰米拉类芽孢杆菌的发酵培养基，其特征是，所述发酵培养基为：玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，麸皮8g/L，蔗糖6g/L，碳酸钙5g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠2g/L、初始pH值为6.4-7.4。4.如权利要求1-3中任意一项所述的一种杰米拉类芽孢杆菌的发酵培养基，其特征是，所述杰米拉类芽孢杆菌为杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04，该菌株保藏号为CGMCCNo.16231。5.一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法，其特征是，将杰米拉类芽孢杆菌活化后，经一级、二级种子液制备和发酵培养，当发酵液中90％以上菌体转化为芽孢时，停止发酵；所述发酵培养采用权利要求1-3中任意一项所述的发酵培养基。6.如权利要求5所述的一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法，其特征是，包括以下步骤：(1)摇瓶一级种子液制备：将活化后的杰米拉类芽孢杆菌转入摇瓶种子培养基，在温度为28-37℃下摇床培养16-30h；(2)种子罐二级种子液制备：将培养好的摇瓶种子液按...

【专利技术属性】
技术研发人员：范建龙，林存銮，邱森森，谢微，
申请(专利权)人：青岛中达农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37