一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：备选芽胞杆菌分离培养准备,对土壤芽孢杆菌分离纯化培养，或已经获得了分离纯化芽孢杆菌菌株；桉树青枯病原菌的培养及菌培养液的制备；在桉树青枯病菌株培养液基础上加入刃天青盐指示剂，加入各种待测芽孢杆菌样品以建立桉树青枯病病菌混合培养体系；并进行培养12小时；对培养后的桉树青枯病混合培养体系的图像进行颜色特征R值提取；通过对照组和处理组的分析比较以确定测试菌株拮抗桉树青枯病的能力以筛选高效拮抗的芽孢杆菌生防菌。本方法操作简便，无需要进行营养平板上进行桉树青枯病病原菌进行对峙培养，可以快速、高效地筛选出具有拮抗的桉树青枯病的芽孢杆菌。

A Screening Method of Bacillus against Eucalyptus Bacterial Blight

The invention discloses a screening method for Bacillus against bacterial wilt of eucalyptus, which includes the following steps: preparation for isolation and culture of selected bacillus, isolation and purification of soil bacillus, or isolation and purification of Bacillus strains; cultivation of pathogenic bacteria of Eucalyptus bacterial wilt and preparation of bacterial culture medium; addition of azure salt finger on the basis of culture liquid of bacterial wilt of Eucalyptus bacteria The mixed culture system of Eucalyptus solanacearum was established by adding various Bacillus samples to be tested, and cultured for 12 hours. The color characteristic R value of the image of the mixed culture system of Eucalyptus solanacearum was extracted. The ability of the tested strains to resist Eucalyptus solanacearum solanacearum was determined by comparing the control group and the treatment group. \u3002 This method is simple and easy to operate. It is not necessary to carry out confrontation culture of pathogenic bacteria of Eucalyptus bacterial wilt on nutritional plate. Bacillus with Antagonistic Bacterial Wilt of Eucalyptus can be screened quickly and efficiently.

【技术实现步骤摘要】
一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法
本专利技术涉及林业生物防治领域，具体涉及一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法。
技术介绍
桉树是我国南方速生丰产商品林的重要树种，广东、广西及海南三省是我国桉树人工商品林主产区，种植面积达440万hm2，占我国桉树人工林总面积的76％。青枯病(Bacterialwilt)是由劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的青枯病是一种土传病害，因具有遗传多样性,其寄主、地理分布、致病性以及生物型均有差异，植株一旦感病，很难防治。桉树青枯病是我国桉树人工林生产的重要病害，随着桉树人工林的不断增加，青枯病的发生日趋严重，已成为当前发展桉树生产的主要障碍之一。青枯病危害严重且控制难度较大，利用有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物以达到控制植物病害的目的，是一种绿色、环保的防治方法,因此应用高效拮抗微生物是预防桉树青枯病发生的有效手段之一。刃天青是氧化还原反应的指示剂,由于其的氧化态和还原态具有不同的颜色。当溶液中滴定体系电对的点位改变时，指示剂电对的浓度也发生改变，因而引起溶液颜色变化。当有溶液中有细菌等微生物生长繁殖时,其代谢能使刃天青还原，并发生不可逆的颜色改变,从蓝紫色→红紫色→淡红紫色→粉红色→淡粉红色→白色的颜色变化,很容易监控或被监控到。根据刃天青的颜色变化判断是否有微生物代谢活动。常规拮抗菌的筛选过程比较繁杂，一般来说，拮抗菌的筛选首先需要对采集来的样品系列稀释后在营养平板上涂布培养，然后把平板上生长出来的所有细菌一一挑取后在另一个营养平板上纯化，纯化后再把细菌一一接种到另一种营养平板上和病原菌进行对峙培养，通过对所有细菌进行拮抗能力的测定最终筛选到拮抗微生物，由于土壤和植株中微生物种类繁多，而拮抗菌所占的比例又非常少，而且平板上的好多细菌是同一个菌株，但是依靠菌株形态很难判断是不是同一个菌，所以在分离细菌、细菌纯化和对峙培养过程需要大量的培养基和大量的分离、纯化和拮抗能力测定的工作。正是由于这种筛选方法过程繁琐，效率低，造成没有更多的时间和精力进行广泛的样品采集，以增加拮抗菌筛选的范围，从而提高筛选到高效拮抗菌的可能性。传统的芽胞杆菌生防菌筛选方法多是以纯化好的菌株然后与筛选的微生物进行平板共培养的对峙试验，以确定是否存在抑菌圈，通过对所有细菌进行拮抗能力的测定最终筛选到拮抗微生物，由于土壤中微生物种类繁多，而拮抗菌所占的比例又极少，所以在分离细菌、细菌纯化和对峙培养过程需要作大量的培养基和大量的分离、纯化和拮抗能力测定等工作。因此采用传统的的这种生防菌筛选方法工作量大，费时费力，效率低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对传统拮抗桉树青枯病芽孢杆菌筛选繁琐且效率较低的难题，提供一种拮抗桉树青枯病病菌快速筛选方法，解决了拮抗桉树青枯病病菌大规模筛选工作量大、时间长的问题。本专利技术采用刃天青作为指示剂添加在芽孢杆菌与桉树青枯病病菌混合培养体系，通过培养后，以常见的数码相机获得其反应体系的图像，通过提取图像颜色特征和参数比较筛选拮抗菌株。该方法反应体系小、节省材料时间，且筛选准确率高，为拮抗桉树青枯的芽孢杆菌大规模筛选提供一条快捷有效的途径。主要是通过土壤微生物芽孢杆菌与桉树青枯病病原菌相互作用时的竞争作用及抗生作用等相结合，在较小的培养体系中通过指示剂颜色反应出芽孢杆菌不同拮抗情况。专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)备选芽胞杆菌分离培养准备称取土壤样品配成10-1浓度(g/mL)，作为土壤悬液原液；土壤悬液稀释为10-4-10-5浓度梯度，置于100℃水浴中3～5分钟后,灭活营养细胞,保留芽孢。配置好芽胞杆菌分离培养基，倒平板,凝固后静置1h，采用稀释平板涂布法吸取土壤悬液涂布到芽孢杆菌培养平板，放入恒温箱中培养24h；(2)桉树青枯病原菌的培养及培养液的制备以取样环取一环已纯化的桉树青枯病菌株，划线于CPG培养基中，培养后取流动性强的菌株扩大培养36-48h后，无菌水洗下菌体，离心，去除上清液，含有无菌水梯度稀释后平板计数，然后用稀释100倍的无菌培养液配成配成108cfu·mL-1培养液保存备用；(3)桉树青枯病病菌混合培养体系建立所述的桉树青枯病病菌混合培养体系为108cfu·mL-1的青枯病病原菌培养液，加入0.01％刃天青盐溶液，加入不同来源的测试的芽孢杆菌菌液，所述青枯病病原菌培养液、刃天青盐溶液、芽孢杆菌菌液的体积比为20:1:1；(4)桉树青枯病病菌混合培养：充分摇匀各处理组混合培养体系，至恒温培养12h；(5)桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取观察培养液的颜色：将不同的处理组培养管按照组平放至白色背景下，使光照均匀，使用图像设备获取图像参数，利用是图像软件提取每个处理组合的培养溶液中典型颜色的RGB特征的R值；(6)拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选筛选桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取颜色特征的R值，通过对照比较统计分析确定处理组是否存在着差异。进一步地，CPG培养基为水解酪蛋白1g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂17g/L，调节pH值6.5-7.0。进一步地，所述无菌培养液为去琼脂的CPG培养液。进一步地，所示图像设备获取图像参数可以使用用相机在体系中心的拍照，当处理组量大时可以固定相机和拍照参数或专业图像设备获取图像参数。进一步地，所述步骤1和4中的恒温箱的温度为35℃。本专利技术的拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其包括以下步骤(1)备选芽胞杆菌分离培养准备称取10g土壤样品至装有90mL无菌水的三角瓶，振荡20min,80℃水浴10min，水浴期间摇匀2-3次，使之水浴充分，即配成10-1浓度，作为土壤悬液原液。土壤悬液稀释为10-4-10-5浓度梯度，采用稀释平板涂布法吸取l00μL土壤悬液涂布到事先倒好芽孢杆菌培养平板(培养基)。将涂好的平板下放静置1h，放入35℃恒温箱中培养24h培养后可以观察到合适数量的芽孢杆菌菌落。(2)桉树青枯病原菌的培养及培养液的制备选择现有的桉树青枯病病原菌或采集来源于的桉树病株青枯病典型症状的茎叶根并经形态学以及分子鉴定的的病原菌(确定为Ralstoniasolanacearum)。对桉树青枯病原菌菌株进行活化培养。超净工作台内取一环已纯化的桉树青枯病菌株，划线于CPG培养基(水解酪蛋白1g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂17g/L，调节pH值6.5-7.0)中，30℃培养24h后取流动性强的菌株扩大培养36-48h后，无菌水洗下菌体，10000×g离心10min，去除上清液，含有无菌水梯度稀释后平板计数，然后用稀释100倍的无菌培养液(去琼脂的CPG培养液)配成配成108cfu·mL-1培养液保存备用。(3)桉树青枯病病菌混合培养体系建立称取适量刃天青盐加双蒸水(ddH2O),配置成0.01％的刃天青盐溶液备用。取培养好的芽孢杆菌菌落菌饼(6mm)，加10mL无菌水,混匀后配成芽孢杆菌液，并将稀释成10-5-10-6芽孢杆菌菌液。根据实际情况设置2个以上不同处理组合，至少含有一个对照组和处理组，每个组至少5以上个重复(管)，反应体系为5mL的洁净、有盖的菌种保存本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)备选芽胞杆菌分离培养准备称取土壤样品配成10‑1g/mL浓度，作为土壤悬液原液；土壤悬液稀释为10‑4‑10‑5g/mL浓度梯度，置于100℃水浴中3～5分钟后,灭活营养细胞,保留芽孢，配置好芽胞杆菌分离培养基，倒平板,凝固后静置1h，采用稀释平板涂布法吸取土壤悬液涂布到芽孢杆菌培养平板，放入恒温箱中培养24h；(2)桉树青枯病原菌的培养及培养液的制备以取样环取一环已纯化的桉树青枯病菌株，划线于CPG培养基中，培养后取流动性强的菌株扩大培养36‑48h后，无菌水洗下菌体，离心，去除上清液，含有无菌水梯度稀释后平板计数，然后用稀释100倍的无菌培养液配成配成108cfu·mL‑1培养液保存备用；(3)桉树青枯病病菌混合培养体系建立所述的桉树青枯病病菌混合培养体系为108cfu·mL‑1的青枯病病原菌培养液，加入0.01％刃天青盐溶液，加入不同测试来源的芽孢杆菌菌液制备得到；所述青枯病病原菌培养液、刃天青盐溶液、芽孢杆菌菌液的体积比为20:1:1；(4)桉树青枯病病菌混合培养：充分摇匀桉树青枯病病菌混合培养体系，恒温培养12h；(5)桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取观察培养液的颜色：将不同的处理组培养管按照组平放至白色背景下，使光照均匀，使用图像设备获取图像参数，利用是图像软件提取每个处理组合的培养溶液中典型颜色的RGB特征的R值；(6)拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选筛选桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取颜色特征的R值，通过对照比较统计分析确定处理组是否存在着差异。...

【技术特征摘要】
1.一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)备选芽胞杆菌分离培养准备称取土壤样品配成10-1g/mL浓度，作为土壤悬液原液；土壤悬液稀释为10-4-10-5g/mL浓度梯度，置于100℃水浴中3～5分钟后,灭活营养细胞,保留芽孢，配置好芽胞杆菌分离培养基，倒平板,凝固后静置1h，采用稀释平板涂布法吸取土壤悬液涂布到芽孢杆菌培养平板，放入恒温箱中培养24h；(2)桉树青枯病原菌的培养及培养液的制备以取样环取一环已纯化的桉树青枯病菌株，划线于CPG培养基中，培养后取流动性强的菌株扩大培养36-48h后，无菌水洗下菌体，离心，去除上清液，含有无菌水梯度稀释后平板计数，然后用稀释100倍的无菌培养液配成配成108cfu·mL-1培养液保存备用；(3)桉树青枯病病菌混合培养体系建立所述的桉树青枯病病菌混合培养体系为108cfu·mL-1的青枯病病原菌培养液，加入0.01％刃天青盐溶液，加入不同测试来源的芽孢杆菌菌液制备得到；所述青枯病病原菌培养液、刃天青盐溶液、芽孢杆菌菌液的体积比为20:1:1；(4)桉树青枯病病菌混合培养：充分摇匀桉树青枯病病菌混合培...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志华，李超，谢耀坚，尚秀华，方良，
申请(专利权)人：国家林业局桉树研究开发中心，
类型：发明
国别省市：广东,44