本发明专利技术涉及一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ‑聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上培养活化；种子液的制备；将活化后的斜面种子接种于种子培养基中，得产γ‑聚谷氨酸的种子液；将种子液接种于发酵培养基中发酵，且发酵时间为24h‑66h时，流加浓度为4g/L‑6g/L的蔗糖溶液；发酵结束后离心去菌体，醇沉析出聚谷氨酸，干燥，制备出干粉状γ‑聚谷氨酸。本发明专利技术在发酵过程中流加蔗糖，利用蔗糖替代葡萄糖或者辅助葡萄糖的方法，不仅可以提高γ‑聚谷氨酸的产量，还能延缓菌体衰老，延长发酵时间。
【技术实现步骤摘要】
一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ-聚谷氨酸的方法
本专利技术属于农业微生物
，涉及一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ-聚谷氨酸的方法。
技术介绍
γ-聚谷氨酸是一种生物高分子载体材料，最早是由lvanovics等人在炭疽芽孢杆菌的夹膜中发现的，是芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌等在生命活动过程中产生的次级代谢产物，当前可以在实验室通过生物发酵的方法制备。随着科技的进步与工业的发展，随之而来的环境污染问题也日益增多，因此各领域更倾向于发展和应用环境友好型材料。而γ-聚谷氨酸作为一种可生物降解的“绿色”高分子材料，也越来越受人们的关注。因其具有良好的吸水特性，并且无论在人体内部，还是在外界环境中其最终的分解代谢产物均为谷氨酸，对人体无毒副作用，对环境无污染，因此在许多领域都展现出其优越性。目前已知，在化妆品行业，食品行业，医疗保健行业，农业方面均有广泛的应用。蔗糖可以由光合作用产生也可以化学合成，广泛分布于植物体内，特别是甜菜、甘蔗和水果中含量极高。蔗糖是植物储藏、积累和运输糖分的主要形式。平时食用的白糖、红糖都是蔗糖。蔗糖由一分子葡萄糖和一分子果糖脱水缩合形成，易溶于水较难溶于乙醇，甜味仅次于果糖。蔗糖是微生物发酵过程中常用的间接性C源，用途之广仅次于葡萄糖。例如专利CN107619841A专利在生产γ-聚谷氨酸时，就添加了蔗糖，其对于蔗糖的添加是作为微生物生长的C源加入，加入时间为菌体对数生长中期，作为主要C源为菌体供给能量，浓度相对较大。但是该方法生产的γ-聚谷氨酸的产量仍较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种新的利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ-聚谷氨酸的方法。本专利技术在发酵过程中流加蔗糖，利用蔗糖降低葡萄糖效应并且减弱葡萄糖容易使菌体衰老的缺点，不仅可以提高γ-聚谷氨酸的产量，还能延缓菌体衰老，延长发酵时间。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃-37℃培养16-18小时，如此活化2-3次，制备成熟的活化后的斜面种子；所述地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.3336；（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；（3）发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤（2）中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度37-38℃，罐压0.02-0.05MPa；通风量0.5-1.5vvm；初始发酵液pH值调至7.0，培养72小时；所述发酵培养基组成为：葡萄糖：80g/L，玉米浆：25g/L，氯化钠：15g/L，MgSO4·7H2O：2g/L，无水氯化钙：1.5g/L，NH4Cl：5.52g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌40min。在发酵时间为24h-66h期间的42h内，均匀流加蔗糖溶液，流加量按培养基体积计算，为每升4g-6g；蔗糖是微生物发酵过程中常用的间接性C源，用途之广仅次于葡萄糖。而且对于许多生物发酵过程中需要诱导产生特定蛋白的微生物来说，蔗糖做C源更有优势，因为葡萄糖效应可能导致所诱导的蛋白表达量低。因此利用蔗糖替代葡萄糖或者辅助葡萄糖的方法是有一定可行性的。我们在实验中发现：在利用蔗糖替换葡萄糖做C源生产γ-聚谷氨酸的过程中发现产量不是很高但菌体OD很高，通过进一步的实验，发现在发酵过程中以葡萄糖为主，流加蔗糖为辅的方法能更好的生产聚谷氨酸且菌体成熟期延长。基于这些特点，流加蔗糖是一种理想的方法1.它能够保证持续的供给菌体C源来提高微生物活性从而提高代谢强度。2.相对于葡萄糖的直接能量供给，蔗糖是边水解边供能，供能缓慢，温和，可以延缓菌体衰老。于是我们尝试了不同的流加浓度，发现从24h-66h流加浓度为4g/L-6g/L的效果最好，流加须均匀，缓慢流加。（4）提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4-5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，干燥；制备出干粉状γ-聚谷氨酸。作为优选的技术方案：优选的，通过高效液相检测样品中γ-聚谷氨酸的产量。优选的，所述斜面培养基组成为胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L,琼脂粉20g/L。优选的，所述种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钾0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌30-40min，得到所述的种子培养基。优选的，所述发酵培养基的pH是使用1～4mol/L硫酸、盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节的。优选的，所述干燥指的是利用喷雾干燥方法，制备出干粉状γ-聚谷氨酸。优选的，所述所述发酵培养基组成为：葡萄糖：80g/L，玉米浆：25g/L，氯化钠：15g/L，MgSO4·7H2O：2g/L，无水氯化钙：1.5g/L，NH4Cl：5.52g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌40min。优选的，所述γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。所述所述蔗糖流加速度为每小时,每L流加0.095g-0.143g.(流加的蔗糖溶液的浓度可根据此范围配置）本专利技术在发酵的中后期24h-66h进行了蔗糖流加。不仅可以提高γ-聚谷氨酸的产量还能延缓菌体衰老，延长发酵时间。有益效果：本申请的蔗糖添加作为诱导剂和保护剂对菌体进行刺激：1.主要作用是提高菌体代谢活力，延缓菌体衰老；2.本申请蔗糖的必须维持在低浓度下，稍高浓度的添加会降低聚谷氨酸的产量，所以必须进行流加，不能分批加入；3.本申请蔗糖加入时间为菌体生长成熟期以后；4.本申请蔗糖不作为菌体的C源加入，原培养基的C源浓度足够。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养18小时，制备成熟的斜面种子；所述地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.3336；（2）种子液的制备：将活化后的斜面种子接种于装有50mL液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，参考以OD660值长在0.3则可所述种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ‑聚谷氨酸的方法，其特征是，包括以下步骤：菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃‑37℃培养16‑18小时，制备活化后的斜面种子；所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No.3336；（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，得到产γ‑聚谷氨酸的种子液；（3）发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤（2）中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度37‑38℃，罐压0.02‑0.05MPa；通风量0.5‑1.5vvm；初始发酵液pH值调至7.0，培养72小时；在发酵时间为24h‑66h期间的42h内，均匀流加蔗糖溶液，流加量按培养基体积计算，为每升4g‑6g；（4）提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4‑5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，干燥；制备出干粉状γ‑聚谷氨酸。...
【技术特征摘要】
1.一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，包括以下步骤：菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃-37℃培养16-18小时，制备活化后的斜面种子；所述地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.3336；（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；（3）发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤（2）中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度37-38℃，罐压0.02-0.05MPa；通风量0.5-1.5vvm；初始发酵液pH值调至7.0，培养72小时；在发酵时间为24h-66h期间的42h内，均匀流加蔗糖溶液，流加量按培养基体积计算，为每升4g-6g；（4）提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4-5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，干燥；制备出干粉状γ-聚谷氨酸。2.根据权利要求1所述的一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，通过高效液相检测样品中γ-聚谷氨酸的产量。3.根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，姜美求，范袆立，李洪，郭鹏，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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