本发明专利技术提供一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε‑聚赖氨酸的发酵方法。以丝瓜络或海绵作为细胞固定载体，安装固定于发酵罐内搅拌子、轴及档板，随后加入发酵培养基，灭菌冷却后接入液体种子。发酵过程细胞吸附至固定化载体，实现细胞固定化；在ε‑聚赖氨酸合成阶段间歇流加灭过菌的有机氮源溶液；当发酵液中ε‑聚赖氨酸积累至3.0 g/L时，采用离子交换树脂离位分离ε‑聚赖氨酸，当发酵液重新积累至3.0 g/L时重复分离过程。本发明专利技术采用细胞固定化和离位分离技术相结合用于ε‑聚赖氨酸发酵，并结合有机氮源间歇流加，可有效促进细胞生长、产物合成以及延长合成期，显著提高ε‑聚赖氨酸发酵产量，具有实际应用推广前景。
【技术实现步骤摘要】
一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法
本专利技术属于生物工程应用领域，涉及一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法。
技术介绍
ε-聚赖氨酸是链霉菌合成的一种胞外L-赖氨酸多聚合物，其赖氨酸残基通过α-羧基与ε-氨基脱水缩合连接，为一种异型肽，分子量通常为3500-4000。ε-聚赖氨酸抑菌谱极广，对细菌、酵母菌、霉菌以及病毒均具有抑菌活性，且抑菌浓度低。抑菌机理为带正电的ε-聚赖氨酸经静电作用吸附至带负电荷的微生物细胞表面，破坏细胞质膜和致使胞内物质泄漏，起到抑制或杀灭微生物的作用。此外ε-聚赖氨酸还具有耐热、水溶性好、可食用、可生物降解、无毒等优点，因此，ε-聚赖氨酸是一种理想的高安全性天然食品防腐剂。当前食品工业主要使用化学合成类防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸钙、亚硝酸盐等，但这些化学合成类防腐剂对人体具有潜在危害，因此，天然来源的防腐剂由于其高安全性受到人们的亲睐，其代替化学合成类防腐剂用于食品防腐保鲜成为今后的必然趋势。ε-聚赖氨酸作为一种微生物源的食品防腐剂已在日本、韩国、美国等国家得到广泛应用。2014年，我国批准ε-聚赖氨酸可作为一种食品防腐剂添加至食品中以防腐和保鲜，因此，ε-聚赖氨酸在我国食品工业中的需求将不断增长，市场需求大。目前，ε-聚赖氨酸主要通过微生物发酵法进行生产，也是迄今为止惟一具有经济性的生产方法，在日本已采用该法进行商业化生产。报道显示ε-聚赖氨酸发酵大多主要采用自由细胞，但这不利于提高发酵液中的细胞浓度，是ε-聚赖氨酸低发酵产量的一个重要因素；另外，ε-聚赖氨酸作为一种次级代谢产物，发酵过程中ε-聚赖氨酸积累至一定水平后其抑制细胞的进一步合成，不利于提高ε-聚赖氨酸产率，因此，ε-聚赖氨酸发酵方法开发中须克服上述2种显著不利因素，将进一步提高ε-聚赖氨酸发酵产量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法，能够获得极高的ε-聚赖氨酸产量，且发酵结束时也完成了产物回收。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：（1）以丝瓜络或海绵（切割为长宽厚约20cm×10cm×1.5cm，或其它规格，视发酵罐大小而定）为固定化载体，先将其安装固定于发酵罐搅拌子、轴以及档板；随后将发酵培养基（配方为葡萄糖50g/L；酵母粉5g/L；(NH4)2SO410g/L；KH2PO41.36；K2HPO40.8g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；ZnSO4·7H2O0.04g/L；FeSO4·7H2O0.03g/L）加入发酵罐内，121℃灭菌30min，冷却至约30℃时用12.5%氨水将培养基起始pH调至6.8。（2）按接种量5%(v/v)将ε-聚赖氨酸产生菌（一种链霉菌）液体种子接入发酵罐，发酵条件为搅拌子不工作即转速为0，温度30℃，通气量1.0vvm。（3）发酵过程产生菌细胞吸附并生长于固定化载体，发酵液中游离细胞极少。（4）发酵开始后发酵液pH持续下降，当降至3.8即产生菌细胞开始合成ε-聚赖氨酸时，此时开始向发酵液间歇流加灭过菌的有机氮源溶液，目的在于避免发酵培养基中生长因子以及氮源缺乏，以强化细胞生长、促进ε-聚赖氨酸合成以及延长细胞产物合成时间。另外，从此时开始利用12.5%氨水使pH维持3.8直至发酵结束。采用的有机氮源溶液为灭过菌的酵母粉溶液或玉米浆溶液或食用菌菌渣提取液；使用200g/L酵母粉溶液时，每升发酵液中每小时加入0.5mL；使用250g/L玉米浆溶液时，每升发酵液中每小时加入1.2mL；使用食用菌菌渣提取液时，每升发酵液中每小时加入2mL。所述的食用菌菌渣提取液是以食用菌菌渣为原料，其制备方法为：取相同重量菌渣2份，其中一份采用酸提取，另一份采用碱提取；酸提取条件为：0.1moL/L硫酸溶液，温度90℃，时间2小时，料液比为1:5g/mL；碱提取条件为：0.1moL/L氢氧化钙溶液，温度90℃，时间2小时，料液比为1:5g/mL；提取后将两者混合并浓缩，每1000g菌渣制备100mL提取液。（5）发酵过程细胞利用发酵培养基中的葡萄糖，当降至10g/L以下时，流加灭过菌的浓度为600g/L葡萄糖补料至发酵液，使其浓度维持于10g/L水平至发酵结束。（6）当发酵液ε-聚赖氨酸积累至3.0g/L时，利用蠕动泵的压力使发酵液经软管（发酵液入口端的管口用纱布包裹）通过罐外的灭过菌的离子交换树脂（D152树脂）以分离发酵液中的ε-聚赖氨酸，并使发酵液重新流入罐内，一直循环至发酵液中的ε-聚赖氨酸完全分离。当发酵液重新积累至3g/L时重复分离过程。（7）发酵至20d时固定化细胞开始大量从固定化材料脱落和死亡，发酵液变混浊，ε-聚赖氨酸的离位分离困难，且此时发酵细胞ε-聚赖氨酸合成产率极低，作为发酵终点，发酵液ε-聚赖氨酸总浓度40g/L以上。本专利技术的有益效果主要体现在：细胞固定化和离位分离技术同时应用ε-聚赖氨酸发酵，并结合有机氮源流加，可显著提高ε-聚赖氨酸发酵产率。该发酵方法中的固定化技术用于提高发酵细胞浓度，同时细胞固定化又可使发酵液中仅含极少量游离细胞，这有利于ε-聚赖氨酸的离位分离，构成了一个完善的发酵系统；该发酵方法中离子交换树脂用于离位分离ε-聚赖氨酸，可克服代谢产物ε-聚赖氨酸的终端抑制效应；此外该发酵方法中发酵与产物分离同时完成，减少了ε-聚赖氨酸回收工艺；该发酵方法中采用有机氮源间歇流加，有利于提高菌体浓度，促进ε-聚赖氨酸合成以及延长发酵周期，有效提高ε-聚赖氨酸发酵产量。附图说明图1工艺示意图。注：1，发酵罐；2，固定化载体；3，软管；4，蠕动泵；5，阀门；6，玻璃柱；7，D152树脂。具体实施方式本专利技术提供了一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法，下面实施例来进一步描述本专利技术的使用方法，但这些实施例仅是规范性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。此外，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本专利技术保护范围。实施例11.孢子悬液制备ε-聚赖氨酸产生菌为不吸水链霉菌(Streptomycesahygroscopicus)GIM8，将其新鲜的斜面菌种划线接种至燕麦琼脂培养基（制备方法如下）平板，30℃倒置培养7d，无菌水洗涤收集孢子，制备孢子悬液，使孢子浓度约为5×108孢子/mL，作为制备液体种子的接种物；燕麦琼脂培养基制备（以1L为例）：称取40g燕麦，自来水洗涤后置于1200mL去离子水中煮沸提取10min，过滤弃渣，滤液中加入18g琼脂，加热完全溶解，补水至1L，121℃灭菌30min，用于平板制备。2.液体种子制备将10mL孢子悬液接种至500mL发酵培养基（装于1L三角瓶），培养条件为温度30℃，转速150rev/min，20h，即为所制备的液体种子。发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖50；酵母粉5；(NH4)2SO410；KH2PO41.36；K2HPO40.8；MgSO4·7H2O0.5；ZnSO4·7H2O0.04；FeSO4·7H2O0.03；pH7.2。121°C灭菌20min。3.固定化栽体安装及固定以丝瓜络为细胞固定化栽体（切割为长宽厚约20cm×本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε‑聚赖氨酸的发酵方法，其特征在于：所述发酵方法包括如下步骤：（1）以丝瓜络或海绵为细胞固定化载体，先将其安装固定于发酵罐搅拌子、轴以及档板；随后将发酵培养基加入发酵罐内，121℃灭菌30 min，冷却至约30℃时用12.5wt.%氨水将培养基起始pH调至6.8；（2）按接种量 5% v/v将ε‑聚赖氨酸产生菌的液体种子接入发酵罐，发酵条件为搅拌子不工作即转速为0，温度30℃，空气流量1.0 vvm；（3）发酵过程中产生菌细胞吸附并生长于固定化载体，发酵液中游离细胞极少；（4）发酵开始后发酵液pH持续下降，当降至3.8即产生菌细胞开始合成ε‑聚赖氨酸时，此时开始向发酵液间歇补加灭过菌的有机氮源溶液；从此时开始利用12.5wt.%氨水使pH维持3.8直至发酵结束；（5）发酵过程细胞利用培养基中的葡萄糖，当葡萄糖降至10 g/L以下时，流加灭过菌的浓度为600 g/L葡萄糖补料至发酵液，使其浓度维持于10 g/L水平至发酵结束；（6）当发酵液ε‑聚赖氨酸积累至3.0 g/L时，利用蠕动泵的压力使发酵液经软管通过罐外灭过菌的离子交换树脂以分离发酵液中的ε‑聚赖氨酸，并使发酵液重新流入罐内，一直循环至发酵液中的ε‑聚赖氨酸完全分离；当发酵液重新积累至3 g/L时重复分离过程；（7）发酵至18‑20 d时，固定化细胞开始从固定化载体脱落和大量死亡，发酵液变混浊，ε‑聚赖氨酸的离位分离困难，且此时发酵细胞ε‑聚赖氨酸合成产率极低，作为发酵终点，ε‑聚赖氨酸发酵总浓度达到40 g/L以上。...
【技术特征摘要】
1.一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法，其特征在于：所述发酵方法包括如下步骤：（1）以丝瓜络或海绵为细胞固定化载体，先将其安装固定于发酵罐搅拌子、轴以及档板；随后将发酵培养基加入发酵罐内，121℃灭菌30min，冷却至约30℃时用12.5wt.%氨水将培养基起始pH调至6.8；（2）按接种量5%v/v将ε-聚赖氨酸产生菌的液体种子接入发酵罐，发酵条件为搅拌子不工作即转速为0，温度30℃，空气流量1.0vvm；（3）发酵过程中产生菌细胞吸附并生长于固定化载体，发酵液中游离细胞极少；（4）发酵开始后发酵液pH持续下降，当降至3.8即产生菌细胞开始合成ε-聚赖氨酸时，此时开始向发酵液间歇补加灭过菌的有机氮源溶液；从此时开始利用12.5wt.%氨水使pH维持3.8直至发酵结束；（5）发酵过程细胞利用培养基中的葡萄糖，当葡萄糖降至10g/L以下时，流加灭过菌的浓度为600g/L葡萄糖补料至发酵液，使其浓度维持于10g/L水平至发酵结束；（6）当发酵液ε-聚赖氨酸积累至3.0g/L时，利用蠕动泵的压力使发酵液经软管通过罐外灭过菌的离子交换树脂以分离发酵液中的ε-聚赖氨酸，并使发酵液重新流入罐内，一直循环至发酵液中的ε-聚赖氨酸完全分离；当发酵液重新积累至3g/L时重复分离过程；（7）发酵至18-20d时，固定化细胞开始从固定化载体脱落和大量死亡，发酵液变混浊，ε-聚赖氨酸的离位分离困难，且此时发酵细胞ε-聚赖氨酸合成产率极低，作为发酵终点，ε-聚赖氨酸发酵总浓度达到40g/L...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘盛荣，张维瑞，孙端方，杨小鹃，
申请(专利权)人：宁德师范学院，
类型：发明
国别省市：福建,35
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