一种γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法技术

本发明专利技术提供了一种γ‑L‑谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：(1)将具有γ‑谷氨酰转肽酶活性的菌株在培养基中培养发酵，发酵液离心后得含γ‑谷氨酰转肽酶的湿菌体；(2)将湿菌体中加入转化液，并于35‑50℃，pH 6‑11条件下酶促反应，等电点结晶法分离得γ‑L‑谷氨酰正丙胺；转换液包括L‑谷氨酸‑γ‑甲酯、正丙胺，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。本发明专利技术采用γ‑谷氨酰转肽酶的特定菌株于培养基中培养，高效表达γ‑谷氨酰转肽酶，使酶法合成γ‑L‑谷氨酰正丙胺有较高的催化速率和转化率；并且，反应条件温和、酶立体选择性强、催化效率高、成本低、工艺流程简单，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法
本专利技术涉及γ-L-谷氨酰正丙胺的制备领域，尤其涉及一种γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法。
技术介绍
γ-L-谷氨酰正丙胺是一种重要的γ-谷氨酰烷基胺，γ-谷氨酰烷基胺具有重要的生理活性。γ-L-谷氨酰正丙胺可用于医药领域，具有非常广泛的应用前景。γ-谷氨酰转肽酶(EC2.3.2.2)作为一种重要的酶参与谷氨酰循环反应，它能特异性地催化谷氨酰基团的迁移过程，从而获得含有谷氨酰基团化合物。目前为止，利用γ-谷氨酰转肽酶催化合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸、谷胱甘肽、茶氨酸、γ-谷氨酰-牛磺酸等化合物的报道很多，但却尚未有利用该酶制备γ-L-谷氨酰正丙胺的报道。据此，目前急需一种利用γ-谷氨酰转肽酶制备γ-L-谷氨酰正丙胺的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种以γ-谷氨酰转肽酶为酶源的γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法。本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：一种γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：(1)将具有γ-谷氨酰转肽酶活性的菌株在培养基中培养发酵，发酵液离心后得到含γ-谷氨酰转肽酶的湿菌体；(2)将上述湿菌体中加入转化液，并于35-50℃，pH6-11条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离后得到γ-L-谷氨酰正丙胺；其中，转换液具体包括L-谷氨酸-γ-甲酯、正丙胺，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中，具有γ-谷氨酰转肽酶活性的菌株选自枯草芽孢杆菌CGMCCNO:1.1628、大肠杆菌ATCC15489、施氏假单胞菌CGMCCNO:1.202以及铜绿假单胞菌CGMCCNO：1.1129中的一种。作为本专利技术的优选方式之一，所述枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、施氏假单胞菌和铜绿假单胞菌均直接购自国内外市场。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中，培养基成分包括：10-45g/L碳源物质、5-40g/L氮源物质、1.5g/L柠檬酸、2.0g/L硫酸铵、4.0g/LK2HPO4、2.0g/LMgSO4、0.05g/LCaCl2、0.001g/LCoCl2和0.0002g/LMnC4H6O4·4H2O。作为本专利技术的优选方式之一，所述碳源物质具体采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖中的一种或多种。作为本专利技术的优选方式之一，所述氮源物质具体采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液中的一种或多种。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，L-谷氨酸-γ-甲酯的浓度为5-80g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，正丙胺的浓度为10-120g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇的的浓度为0.001g/L-5.0g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，等电点结晶法分离得γ-L-谷氨酰正丙胺的具体方法如下：(1)将酶促反应后的转化液于3000-5000r/min转速下离心10-20min，去除菌体细胞；(2)加热转化液，采用活性碳脱色，抽滤，再将脱色液通过阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至pH3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得γ-L-谷氨酰正丙胺粗品；(3)采用乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得γ-L-谷氨酰正丙胺精品。作为本专利技术的优选方式之一，所述阳离子交换树脂柱具体为732型阳离子交换树脂柱。本专利技术相比现有技术的优点在于：采用γ-谷氨酰转肽酶的特定菌株于特定培养基中培养，高效表达γ-谷氨酰转肽酶，使酶法合成γ-L-谷氨酰正丙胺有较高的催化速率和转化率；其中，L-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率达到91％以上；酶法合成γ-L-谷氨酰正丙胺更是具有反应条件温和、酶立体选择性强、催化效率高、成本低、工艺流程简单等优点，适合工业化生产。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1本实施例的一种γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：(1)将1000mL大肠杆菌ATCC15489在培养基(10g/L葡萄糖、5g/L牛肉膏、1.5g/L柠檬酸、2.0g/L硫酸铵、4.0g/LK2HPO4、2.0g/LMgSO4、0.05g/LCaCl2、0.001g/LCoCl2和0.0002g/LMnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到12g湿菌体，加入到500mL转化液中(转化液中含40gL-谷氨酸-γ-甲酯、60g正丙胺和0.005g/L乙酸乙酯)，pH6.0，35℃酶促反应12h，反应结束后，L-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率为91％；(2)将转化液3000r/min离心10min，去除菌体细胞；加热，活性碳脱色，抽滤，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至pH3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得37.5gγ-L-谷氨酰正丙胺粗品；质量浓度为95％的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得35.3gγ-L-谷氨酰正丙胺精品，纯度为99.9％。实施例2本实施例的一种γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：(1)将1000mL铜绿假单胞菌CGMCCNO：1.1129在培养基(45g/L麦芽糖、40g/L酵母膏、1.5g/L柠檬酸、2.0g/L硫酸铵、4.0g/LK2HPO4、2.0g/LMgSO4、0.05g/LCaCl2、0.001g/LCoCl2和0.0002g/LMnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体，加入到500mL转化液中，转化液中含20g的L-谷氨酸-γ-甲酯、30g的正丙胺和0.01g/L的乙酸丁酯，pH11，50℃酶促反应12h，反应结束后，L-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率为90％；(2)将转化液5000r/min离心20min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至pH3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得18.7gγ-L-谷氨酰正丙胺粗品；质量浓度为95％的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得16.8gγ-L-谷氨酰正丙胺精品，纯度为99.8％。实施例3本实施例的一种γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：(1)将1000mL施氏假单胞菌CGMCCNO:1.202在培养基(20g/L蔗糖、20g/L玉米浆、1.5g/L柠檬酸、2.0g/L硫酸铵、4.0g/LK2HPO4、2.0g/LMgSO4、0.05g/LCaCl2、0.001g/LCoCl2和0.0002g/LMnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到湿菌体20g，加入到500mL转化液中，转化液中含40g的L-谷氨酸-γ-甲酯、60g的正丙胺和0.02g/L的辛醇，pH7.0，40℃酶促反应12h，反应结束后，L-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率为89％；(2)将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至pH3-4，静置析出沉淀，真空抽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种γ‑L‑谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将具有γ‑谷氨酰转肽酶活性的菌株在培养基中培养发酵，发酵液离心后得到含γ‑谷氨酰转肽酶的湿菌体；(2)将上述湿菌体中加入转化液，并于35‑50℃，pH 6‑11条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离后得到γ‑L‑谷氨酰正丙胺；其中，转换液具体包括L‑谷氨酸‑γ‑甲酯、正丙胺，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。

【技术特征摘要】
1.一种γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将具有γ-谷氨酰转肽酶活性的菌株在培养基中培养发酵，发酵液离心后得到含γ-谷氨酰转肽酶的湿菌体；(2)将上述湿菌体中加入转化液，并于35-50℃，pH6-11条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离后得到γ-L-谷氨酰正丙胺；其中，转换液具体包括L-谷氨酸-γ-甲酯、正丙胺，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。2.根据权利要求1所述的γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，具有γ-谷氨酰转肽酶活性的菌株选自枯草芽孢杆菌CGMCCNO:1.1628、大肠杆菌ATCC15489、施氏假单胞菌CGMCCNO:1.202以及铜绿假单胞菌CGMCCNO：1.1129中的一种。3.根据权利要求1所述的γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，培养基成分包括：10-45g/L碳源物质、5-40g/L氮源物质、1.5g/L柠檬酸、2.0g/L硫酸铵、4.0g/LK2HPO4、2.0g/LMgSO4、0.05g/LCaCl2、0.001g/LCoCl2和0.0002g/LMnC4H6O4·4H2O。4.根据权利要求3所述的γ-L-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，其特征在于，所述碳源物质具体采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖中的一种或多种。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐礼生，
申请(专利权)人：宿州学院，
类型：发明
国别省市：安徽,34