一种添加甲硫氨酸提高γ-聚谷氨酸产量的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种添加甲硫氨酸提高γ‑聚谷氨酸产量的制备方法,所述的制备过程包括：菌种活化：将菌株CGMCC No.3336接种在斜面培养基；种子液培养：将斜面培养基的活化种子接种于种子液培养基中；发酵罐培养，按照以发酵培养基体积计10％接种量，将所述种子液接种于发酵罐中；发酵液培养基包括葡萄糖，NH4Cl，MgSO4·7H2O，无水氯化钙g/L，FeSO4·7H2Og/L，酵母膏，蛋白胨，味精，生长因子；分离提取。该方法可提高聚谷氨酸的产量，提高底物转化率，不仅操作方便，而且在提高产量的同时并其降低了后期聚谷氨酸提取的成本。

A method for increasing production of gamma polyglutamic acid by adding methionine

The invention discloses a preparation method of adding methionine to improve the production of gamma glutamic acid. The preparation process includes: inoculation of strain CGMCC: inoculating the strain No.3336 in the slope culture medium; seed liquid culture: inoculating the activated seed of the slope culture medium in the seed liquid medium; fermentation pot culture, according to fermentation. The seed liquid was inoculated in the fermentation tank with 10% inoculation of the medium volume meter, and the culture medium included glucose, NH4Cl, MgSO4 7H2O, anhydrous calcium chloride g/L, FeSO4. 7H2Og/L, yeast extract, peptone, monosodium glutamate, growth factor, and extraction. The method can improve the production of polyglutamic acid and increase the conversion rate of substrate. It is not only convenient to operate, but also improves the production and reduces the cost of polyglutamic acid extraction at the later stage.

【技术实现步骤摘要】
一种添加甲硫氨酸提高γ-聚谷氨酸产量的制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种添加甲硫氨酸提高γ-聚谷氨酸产量的制备方法。
技术介绍
γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键结合而成的一种多功能生物可降解高分子材料。分子量分布在100kDa到10000kDa之间。γ-聚谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均具有很高的商业价值和社会价值。从聚谷氨酸的发现至今仅有几十年的历史，聚谷氨酸的研究主要还是处于实验室阶段，仅少数企业进行了工业化生产。实验室阶段主要包括对其性质的研究，产生菌的改良和基因研究，发酵过程研究和提取纯化过程研究，以及衍生物的生产和性质的研究。近几年来，由于人们环境意识的增强和国家可持续发展战略的要求，发展对环境友好的材料和开发改善环境问题的产品成为一种产业上的趋势，它也推动了聚谷氨酸产业化研究和探索的进程。进入本世纪，个别国际知名公司开始进行聚谷氨酸的生产和应用的研究，国内部分大学和研究所也积极开展了相关的研究，国内更有数家企业开始计划聚谷氨酸的大规模生产。由于这些产业化研究的跟进，使得聚谷氨酸成为现阶段最受人关注的生物制品之一。生长因子是指微生物生长过程中必须的，必须由外界直接提供的营养成分，常见的生长因子有维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶等。生长因子可以提供微生物重要化学物质、辅助因子（辅酶和辅基）的组分和参与代谢。属于次级代谢产物，在菌体处于对数期后期，稳定期前期开始产生。目前文献当中关于聚谷氨酸产量提高主要是通过菌种诱变、培养基成分优化，往往效果不太明显，发酵周期长，且底物的转化率不高，导致聚谷氨酸成本居高不下。
技术实现思路
为了解决聚谷氨酸传统优化过程中的不足，有针对性的提高聚谷氨酸的产量，提高底物转化率，本专利技术提供了一种添加生长因子甲硫氨酸来提高γ-聚谷氨酸产量的方法，不仅操作方便，而且在提高产量的同时并其降低了后期聚谷氨酸提取的成本。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术公开了一种添加甲硫氨酸提高γ-聚谷氨酸产量的制备方法，所述γ-聚谷氨酸由地衣芽胞杆菌发酵制备：所述地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.3336；制备方法包括：（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养16小时，如此活化2-3次，制备成熟的斜面种子；（2）种子液的制备：将活化后的斜面种子接种于装有50ml液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养16-20小时至对数生长期，参考以OD660值增长到0.3即可。所述种子培养基组成为：酵母膏7g/L，胰蛋白胨10/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH值7.2，余量为纯净水；葡萄糖30g/L单独灭菌后单独添加，葡萄糖和培养基一起灭菌会降低菌体对葡萄糖的转化和利用率，故单独添加，使得味精的转化率提高。（3）发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计10％接种量，将步骤（2）中的种子液接种于发酵罐，以10%的接种量，初始发酵温度37-38℃，罐压0.01-0.05Mpa通风量0.5-1.5vvm，转速400rpm；发酵液的PH值为6.0-7.2，其中，初始发酵液PH值调至7.2。在发酵过程中的前20h控制PH值不低于6.0，20-28h控PH值不低于6.5，后期不用再调节PH值直到发酵结束，发酵时间为72h。所述发酵培养基组分为：葡萄糖78-85g/L，NH4Cl5.32-6g/L，MgSO4·7H2O0.45-0.6g/L，无水氯化钙0.45-0.55g/L，FeSO4·7H2O0.08-0.12g/L，酵母膏10-15g/L，蛋白胨5-10g/L；味精75-85g/L，生长因子0.2-0.6g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；其中味精单独灭菌，单独添加。所述生长因子可以为吡哆醇，腺嘌呤、甲硫氨酸、D-谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺的任意一种，其中甲硫氨酸的效果最佳。味精和培养基一起灭菌会降低菌体对味精的转化和利用率，故单独添加，使得味精的转化率提高。（4）γ-聚谷氨酸的提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4-5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于和上清液等体积的蒸馏水中，利用喷雾干燥方法制备出黄色干粉状聚谷氨酸。最后通过高效液相（紫外或示差）检测各自样品的聚谷氨酸产量。所述添加生长因子的优化过程：γ-聚谷氨酸属于次级代谢产物，在微生物对数期后期、稳定期前期开始产生有少部分在稳定期后期产生。；为了缩短发酵周期，提高底物转化率，优化培养基，采取发酵培养基其余成分不变，单个生长因子对聚谷氨酸的发酵合成具有较大促进作用，且成本较低。实验室经过大量研究，和对生长因子种类的筛选，对用量进行了优化，得出：添加甲硫氨酸其γ-聚谷氨酸产量最高，得到的γ-聚谷氨酸效果明显增加，且甲硫氨酸0.6g/L得到的聚谷氨酸的产量是最高的。发酵过程中pH会降低，使用氢氧化钠溶液调控pH，初始发酵液PH值7.2以及发酵前28小时PH值调节在6.0-6.5，是方便菌体在最适PH范围内，使菌体能够在进入延滞期后快速进入对数期，在发酵后期菌体进入稳定期期间，菌体主要产γ-聚谷氨酸的目的产物，故不再需要调节PH值。通风量过大会使菌体的溶养的到充足，从而使菌体过快的进入对数期，消耗了葡萄糖等培养基底物，使得在稳定期菌体没有充足的底物维持，进而影响聚谷氨酸目的产物的量，所以通风量及罐压必须在合适的范围内进行调节。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：（1）本专利技术提供了添加甲硫氨酸生长因子和该生长因子的添加量提高γ-聚谷氨酸产量最高的方法，有针对性的根据不同生长因子种类和发酵过程中添加不同的量特点来比较其对化妆品级γ-聚谷氨酸的产量的促进作用。（2）本专利技术针对地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336发酵生产化妆品级γ-聚谷氨酸过程中存在产量低、底物转化率低的缺陷。经过培养基的优化研究，针对性的加入甲硫氨酸促进了终产物γ-聚谷氨酸生成。极大地缩短了培养基优化的周期，提高聚谷氨酸的产量，提高底物转化率，不仅操作方便，而且在提高产量的同时并其降低了后期聚谷氨酸提取的成本。（3）本专利技术的制备方法简便，可行性高，能作为工业化生产化妆品级γ-聚谷氨酸，其转化率适合工业化生产，提高了底物的利用效率，且发酵周期较短，大大降低了设备的损耗，以及设备利用率等成本。具体实施方案实施例1：菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养18小时，制备成熟的斜面种子；斜面培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）TKPG09本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种添加甲硫氨酸提高γ‑聚谷氨酸产量的制备方法，采用的菌株为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，该菌株已于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No.3336；其特征在于，制备过程包括：（1）菌种活化：将菌株CGMCC No.3336接种在斜面培养基；（2）种子液制备：将斜面培养基上的活化的菌种接种于种子液培养基中，培养至OD660值增长到0.3时即可；（3）发酵罐培养：按照以发酵培养基体积计10％接种量，将所述种子液接种于发酵罐中，发酵液的pH值为6.0‑7.2；发酵液培养基包括葡萄糖，NH4Cl，MgSO4·7H2O，无水氯化钙g/L，FeSO4·7H2Og/L，酵母膏，蛋白胨，味精，甲硫氨酸；（4）分离提取。

【技术特征摘要】
1.一种添加甲硫氨酸提高γ-聚谷氨酸产量的制备方法，采用的菌株为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis，该菌株已于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.3336；其特征在于，制备过程包括：（1）菌种活化：将菌株CGMCCNo.3336接种在斜面培养基；（2）种子液制备：将斜面培养基上的活化的菌种接种于种子液培养基中，培养至OD660值增长到0.3时即可；（3）发酵罐培养：按照以发酵培养基体积计10％接种量，将所述种子液接种于发酵罐中，发酵液的pH值为6.0-7.2；发酵液培养基包括葡萄糖，NH4Cl，MgSO4·7H2O，无水氯化钙g/L，FeSO4·7H2Og/L，酵母膏，蛋白胨，味精，甲硫氨酸；（4）分离提取。2.根据权利要求1所述的一种添加甲硫氨酸提高γ-聚谷氨酸产量的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖78-85g/L，NH4Cl5.32-6g/L，MgSO4·7H2O0.45-0.6g/L，无水氯化钙0.45-0.55g/L，FeSO4·7H2O0.08-0.12g/L，酵母膏10-15g/L，蛋白胨5-10g/L；味精75-85g/L，甲硫氨酸0.2-0.6g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；其中味精单独灭菌，单独添加。3.根据权利要求1或2所述的一种添加甲硫氨酸提高γ-聚谷氨酸产...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，汪建英，张卫，
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12