双环霉素生物合成中氧化酶的功能及其应用制造技术

本发明专利技术公开了双环霉素生物合成中氧化酶的功能及其应用，具体地，本发明专利技术提供了双环霉素合成中的六个氧化酶BcmB，BcmC，BcmD，BcmE，BcmF和BcmG，以及其用于催化以异亮氨酸‑亮氨酸环二肽(cIL)为初始底物的多步氧化反应，最终生成双环霉素的用途。本发明专利技术的方法可以应用于在体外以环二肽作为起始原料，高效生产双环霉素或其结构类似物。

Function and application of biosynthesis of biosynthesis in biosynthesis of biosynthesis

【技术实现步骤摘要】
双环霉素生物合成中氧化酶的功能及其应用
本专利技术属于生物技术和工程领域，具体地，本专利技术涉及双环霉素生物合成途径中几个氧化酶的功能及其应用。
技术介绍
双环霉素是1972年由日本科学家从札幌链霉菌Streptomycessapporonensis中分离得到的一种抗生素，它对很多革兰氏阴性菌和至少一种革兰氏阳性菌都具有杀菌作用。在临床上，双环霉素被用来治疗人的腹泻以及小牛和猪的细菌性痢疾、鱼类的假结核病，也被用于促进小鸡和猪的生长。最近的研究表明，当双环霉素与四环素、氯霉素、利福平等目前广泛使用的抗生素一起使用时，可以产生非常强的协同作用，大大提高这些抗生素的抗菌活性。双环霉素(图1)的结构非常特殊，与已知的其他种类的抗生素没有结构相似性，其结构可以分为三部分：[4,2,2]-双环骨架、C-1三羟基基团以及C5-C5a环外亚甲基，这使其抗菌的作用机制也与其他种类抗生素不同。双环霉素抗菌机制极其独特，被认为是目前已知的唯一一个来源于天然产物的转录终止因子Rho蛋白的选择性抑制剂。从双环霉素被发现开始，很多有机合成化学家就对它的体外全合成产生了很大的兴趣，双环霉素最简单且立体专一性的有机化学全合成由Williams等在1984年完成，但是整个合成路线经过了12步，总产率很低。因此，我们在获得双环霉素生物合成基因的基础上，采用化学合成前体加体外酶催化合成的方式，建立了全新的双环霉素制备方法。与传统的有机全合成相比，体外酶催化全合成具有独特的优势：首先，酶的高效性使得酶催化合成中每一步反应的催化效率都比较高；其次，酶催化反应一般都具有非常好的立体选择性和区域选择性，这样在合成复杂的天然产物时就可以轻松的构建多个手性中心，得到单一构型的目标产物；再者，由于酶催化反应的特异性，进行体外酶催化全合成时，体系内副反应和副产物都比较少，所以酶催化全合成比较容易实现体外一锅法，进一步提高了反应的效率；另外，体外酶催化所需的反应条件相对比较温和，能源消耗较少，更加绿色环保。综上所述，本领域迫切需要开发一种双环霉素的体外酶催化合成方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种双环霉素的体外酶催化合成方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种催化制备双环霉素(Biocyclomycin)的方法，所述方法包括步骤：(i)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE和任选的辅酶存在的条件下，用式I化合物进行反应，得到式II化合物；(ii)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC和任选的辅酶存在的条件下，用式II化合物反应，得到式III化合物；(iii)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG和任选的辅酶存在的条件下，用式III化合物反应，得到式IV化合物；(iv)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmB和任选的辅酶存在的条件下，用式IV化合物反应，得到式V化合物；(v)在辅酶和细胞色素P450单加氧酶BcmD存在的条件下，用式V化合物反应，得到式VI化合物；和(vi)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmF和任选的辅酶存在的条件下，用式VI化合物反应，形成双环霉素(Biocyclomycin)：在另一优选例中，所述的步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)在同一反应体系中进行。在另一优选例中，所述的步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)结束后，不分离产物，直接进行下一步反应。在另一优选例中，所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和细胞色素P450单加氧酶BcmD来自于札幌链霉菌(Streptomycessapporonensis)；优选地，所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE的序列如SEQIDNO：1所示；所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC的序列如SEQIDNO：3所示；所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG的序列如SEQIDNO：5所示；所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmB的序列如SEQIDNO：7所示；所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmF的序列如SEQIDNO：11所示；所述的细胞色素P450单加氧酶BcmD的序列如SEQIDNO：9所示。在另一优选例中，所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和/或细胞色素P450单加氧酶BcmD为在大肠杆菌中表达的重组蛋白。在另一优选例中，所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和/或细胞色素P450单加氧酶BcmD为分离的或重组的。在另一优选例中，所述的多步氧化反应可以分步完成，也可以在同一反应体系内完成(即一锅法完成)。在另一优选例中，所述的步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)各自独立地在具有选自下组的一个或多个特征的反应体系中进行反应：(a)α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和细胞色素P450单加氧酶BcmD的单酶浓度为0.001-100mM；(b)反应体系的pH为6.0-9.0；(c)反应温度为15-45摄氏度；和(d)反应体系中，辅酶的浓度为0.01-100mM。在另一优选例中，所述的方法在α-酮戊二酸存在下进行反应；优选地，所述的α-酮戊二酸的浓度为0.01-100mM。在另一优选例中，所述的方法在抗坏血酸存在下进行反应；优选地，所述的抗坏血酸的浓度为0.01-100mM。在另一优选例中，所述的方法在硫酸亚铁存在下进行反应；优选地，所述的硫酸亚铁的浓度为0.01-100mM。在另一优选例中，所述的反应体系中，各个底物的浓度分别为0.01-100mM。在另一优选例中，所述的辅酶选自下组：NADPH，Ferredoxin，FerredoxinReductase，或其组合。本专利技术的第二方面，提供了一种α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE的用途，它用于催化下述氧化反应：其中，所述α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE来自于札幌链霉菌(Streptomycessapporonensis)，并且所述α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE的序列如SEQIDNO：1所示；和/或所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE由SEQIDNO：2所示的核苷酸序列编码。本专利技术的第三方面，提供了一种α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC的用途，它用于催化下述氧化反应：其中，所述α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC来自于札幌链霉菌(Streptomycessapporonensis)，并且所述α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC的序列如SEQIDNO：3所示；和/或所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC由SEQIDNO：4所示的核苷酸序列编码。本专利技术的第四方面，提供了一种α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG的用途，它用于催化下述氧化反应：其中，所述α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG来自于札幌链霉菌(Streptomycessapporonensis)，并且所述α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG的序列如SEQIDNO：5所示；和/或所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG由SEQIDNO：6所示的核苷酸序列编码。本专利技术的第五方面，提供了一种α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmB的用途，它用于催化下述氧化反应：其中，所述α-酮戊本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种催化制备双环霉素(Biocyclomycin)的方法，其特征在于，包括步骤：(i)在α‑酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE和任选的辅酶存在的条件下，用式I化合物进行反应，得到式II化合物；(ii)在α‑酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC和任选的辅酶存在的条件下，用式II化合物反应，得到式III化合物；(iii)在α‑酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG和任选的辅酶存在的条件下，用式III化合物反应，得到式IV化合物；(iv)在α‑酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmB和任选的辅酶存在的条件下，用式IV化合物反应，得到式V化合物；(v)在辅酶和细胞色素P450单加氧酶BcmD存在的条件下，用式V化合物反应，得到式VI化合物；和(vi)在α‑酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmF和任选的辅酶存在的条件下，用式VI化合物反应，形成双环霉素(Biocyclomycin)：

【技术特征摘要】
1.一种催化制备双环霉素(Biocyclomycin)的方法，其特征在于，包括步骤：(i)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE和任选的辅酶存在的条件下，用式I化合物进行反应，得到式II化合物；(ii)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC和任选的辅酶存在的条件下，用式II化合物反应，得到式III化合物；(iii)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG和任选的辅酶存在的条件下，用式III化合物反应，得到式IV化合物；(iv)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmB和任选的辅酶存在的条件下，用式IV化合物反应，得到式V化合物；(v)在辅酶和细胞色素P450单加氧酶BcmD存在的条件下，用式V化合物反应，得到式VI化合物；和(vi)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmF和任选的辅酶存在的条件下，用式VI化合物反应，形成双环霉素(Biocyclomycin)：2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和细胞色素P450单加氧酶BcmD来自于札幌链霉菌(Streptomycessapporonensis)；优选地，所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE的序列如SEQIDNO：1所示；所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC的序列如SEQIDNO：3所示；所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG的序列如SEQIDNO：5所示；所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmB的序列如SEQIDNO：7所示；所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmF的序列如SEQIDNO：11所示；所述的细胞色素P450单加氧酶BcmD的序列如SEQIDNO：9所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和/或细胞色素P450单加氧酶BcmD为在大肠杆菌中表达的重组蛋白。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)各自独立地在具有选自下组的一个或多个特征的反应体系中进行反应：(a)α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和细胞色素P450单加氧酶BcmD的单酶浓度为0.001-100mM；(b)反应体系的pH为6.0-9.0；(c)反应温度为15-45摄氏度；和(d)反应体系中，辅酶的浓度为0.01-100mM。5.一种α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE的用途，其特征在于，它用...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐功利，孟松，潘海学，赵娟，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31