一种农业级γ‑聚谷氨酸的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种农业级γ‑聚谷氨酸的生产方法，包括以下步骤：菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上培养活化；种子液的制备；将活化后的斜面种子接种于种子培养基中，得产γ‑聚谷氨酸的种子液；将种子液接种于发酵培养基中发酵；发酵结束后离心去菌体，醇沉析出聚谷氨酸，干燥，制备出黄色干粉状农业级聚谷氨酸。本发明专利技术通过实验室对农业级聚谷氨酸的发酵研究中发现钾盐类对农业级聚谷氨酸合成具有较大促进作用，通过添加氯化钾，提高农业级产量的方法提高底物转化率，不仅操作方便，而且在提高产量的同时相比化妆品级别的聚谷氨酸，其降低了后期聚谷氨酸提取的成本。

A method for producing agricultural grade gamma polyglutamic acid

The invention relates to a method for producing agricultural grade gamma polyglutamic acid, which comprises the following steps: strain activation: Bacillus licheniformis original strain was inoculated in slant culture culture based activation; seed liquid preparation; will be activated after inoculation in slant seed seed medium, seed production by liquid poly glutamic acid; seeds were inoculated in fermentation medium fermentation; fermentation after centrifugation to bacteria, alcohol precipitation polyglutamic acid, drying, preparation of yellow powder agricultural grade poly glutamic acid. Study on the fermentation of the invention of poly glutamic acid found in the laboratory by agricultural grade potassium salts has great promoting effect on agricultural grade poly glutamic acid synthesis by adding potassium chloride, improve the substrate conversion method to improve the agricultural production level, not only has the advantages of convenient operation, and compared with the level of Poly glutamic acid in cosmetics and improve yield, reduce the late poly glutamic acid extraction cost.

【技术实现步骤摘要】
一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法
本专利技术属于农业微生物
，涉及一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法。
技术介绍
γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键结合而成的一种多功能生物可降解高分子材料。分子量分布在100kDa到10000kDa之间。γ-聚谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均具有很高的商业价值和社会价值。从聚谷氨酸的发现至今仅有几十年的历史，聚谷氨酸的研究主要还是处于实验室阶段，仅少数企业进行了工业化生产。实验室阶段主要包括对其性质的研究，产生菌的改良和基因研究，发酵过程研究和提取纯化过程研究，以及衍生物的生产和性质的研究。近几年来，由于人们环境意识的增强和国家可持续发展战略的要求，发展对环境友好的材料和开发改善环境问题的产品成为一种产业上的趋势，它也推动了聚谷氨酸产业化研究和探索的进程。进入本世纪，个别国际知名公司开始进行聚谷氨酸的生产和应用的研究，国内部分大学和研究所也积极开展了相关的研究，国内更有数家企业开始计划聚谷氨酸的大规模生产。由于这些产业化研究的跟进，使得聚谷氨酸成为现阶段最受人关注的生物制品之一。目前文献当中关于聚谷氨酸产量提高主要是通过菌种诱变、培养基成分优化，往往效果不太明显，发酵周期长，且底物的转化率不高，导致聚谷氨酸成本居高不下。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法。本专利技术提供了一种分别添加氯化钾、硫酸钾等钾盐来提高农业级产量的方法提高底物转化率，不仅操作方便，而且在提高产量的同时相比化妆品级别的聚谷氨酸，其降低了后期聚谷氨酸提取的成本。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法，包括以下步骤：(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃-37℃培养16-18小时，如此活化2-3次，制备成熟的活化后的斜面种子；本专利技术所用菌种来源:天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为一种高效生产γ-聚谷氨酸的方法，申请号CN201310749908.8。所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.3336；(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，37℃，摇床转速220rpm培养18小时至对数生长期，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，8％～10％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度37-38℃，罐压0.01-0.05MPa；通风量0.5-1.5vvm，发酵罐搅拌转速400rpm；初始发酵液pH值调至7.0-7.7；在发酵前20h控制pH值不低于6.0，20-28h控pH值不低于6.5，后期不用再调节pH值直到发酵结束；发酵时间为72h，发酵过程中pH会降低，我们会使用氢氧化钠溶液调控pH，初始发酵液PH值以及发酵前28小时PH值调节是方便菌体在最适PH范围内，使菌体能够在进入延滞期后快速进入对数期，在发酵后期菌体进入稳定期期间，菌体主要产γ-聚谷氨酸的目的产物，故不再需要调节PH值。通风量过大会使菌体的溶养的到充足，从而使菌体过快的进入对数期，消耗了葡萄糖等培养基底物，使得在稳定期菌体没有充足的底物维持，进而影响聚谷氨酸目的产物的量，所以通风量及罐压必须在合适的范围内进行调节。所述发酵培养基组分为：葡萄糖78-85g/L，NH4Cl5.32-6g/L，MgSO4·7H2O0.45-0.6g/L，无水氯化钙0.45-0.55g/L，FeSO4·7H2O0.08-0.12g/L，酵母膏18-25g/L；味精75-85g/L，钾盐10-18g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；其中味精单独灭菌，单独添加；味精和培养基一起灭菌会降低菌体对味精的转化和利用率，故单独添加，使得味精的转化率提高。所述钾盐为KCl或K2SO4；(4)提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4-5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，干燥；制备出黄色干粉状农业级聚谷氨酸。作为优选的技术方案：优选的，所述发酵培养基组分为：葡萄糖80g/L，NH4Cl5.52g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，无水氯化钙0.5g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，酵母膏20g/L；味精80g/L，钾盐15g/L。优选的，通过高效液相检测样品中农业级聚谷氨酸的产量。优选的，所述种子培养基组成为：酵母膏7g/L，胰蛋白胨10/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH值7.2，葡萄糖30g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌30-40min，得到所述的种子培养基；其中葡萄糖单独灭菌，单独添加。葡萄糖和培养基一起灭菌会降低菌体对葡萄糖的转化和利用率，故单独添加，使得味精的转化率提高。优选的，所述发酵培养基的pH是使用1～4mol/L硫酸、盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节的。优选的，所述干燥指的是利用喷雾干燥方法，制备出黄色干粉状农业级聚谷氨酸。优选的，所述农业级聚谷氨酸的分子量为20万-100万道尔顿，无机盐等盐类是微生物生长过程中必须的，必须由外界直接提供的营养成分，钾盐等无机盐可以提供微生物重要化学物质、辅助因子(辅酶和辅基)的组分和参与代谢。本专利发现通过在培养基中添加不同钾盐成分考察其农业级γ-聚谷氨酸的产量，从而确定添加的最佳钾盐成份。γ-聚谷氨酸属于次级代谢产物，在菌体处于对数期后期，稳定期前期大部分开始产生，有少部分在稳定期后期产生。所述添加钾盐的优化过程：采用的农业级γ-聚谷氨酸的生产过程为：(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养18小时，制备成熟的斜面种子；斜面培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。(2)种子液的制备：将活化后的斜面种子接种于装有50mL液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养18小时至对数生长期，参考以OD660值长在0.3则可所述种子培养基组成为：酵母膏7g/L，胰蛋白胨10/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；葡萄糖30g/L单灭单独添加。(3)发酵罐发酵：将步骤(2)中的种子液1.5L接种于发酵罐，以10％的接种量，30L发酵罐发酵培养基装量为15L，初始发酵温度38℃，罐压0.03MPa，通风量，1vvm，转速400rpm；初始发酵液pH值调至7.0，在发酵前20h控制pH值不低于6.0，20-28h控pH值不低于6.5，后期不用再调节pH值直到发酵结束。所述发酵培养基组分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种农业级γ‑聚谷氨酸的生产方法，其特征是，包括以下步骤：（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃‑37℃培养16‑18小时，制备活化后的斜面种子；（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，37℃，摇床转速220rpm培养18小时至对数生长期，得到产γ‑聚谷氨酸的种子液；（3）发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，8％～10％接种量，将步骤（2）中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度37‑38℃，罐压0.01‑0.05MPa；通风量0.5‑1.5vvm，转速400rpm；初始发酵液pH值调至7.0‑7.7；在发酵前20h控制pH值不低于6.0，20‑28h控pH值不低于6.5，后期不用再调节pH值直到发酵结束；所述发酵培养基组分为：葡萄糖78‑85g/L，NH4Cl 5.32‑6g/L， MgSO4·7H2O 0.45‑0.6g/L，无水氯化钙0.45‑0.55g/L，FeSO4·7H2O 0.08‑0.12g/L，酵母膏18‑25g/L；味精75‑85g/L，钾盐10‑18g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌30‑40min，得到所述的发酵培养基；其中味精单独灭菌，单独添加；所述钾盐为KCl；（4）提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4‑5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，干燥；制备出黄色干粉状农业级聚谷氨酸。...

【技术特征摘要】
1.一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征是，包括以下步骤：（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃-37℃培养16-18小时，制备活化后的斜面种子；（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，37℃，摇床转速220rpm培养18小时至对数生长期，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；（3）发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，8％～10％接种量，将步骤（2）中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度37-38℃，罐压0.01-0.05MPa；通风量0.5-1.5vvm，转速400rpm；初始发酵液pH值调至7.0-7.7；在发酵前20h控制pH值不低于6.0，20-28h控pH值不低于6.5，后期不用再调节pH值直到发酵结束；所述发酵培养基组分为：葡萄糖78-85g/L，NH4Cl5.32-6g/L，MgSO4·7H2O0.45-0.6g/L，无水氯化钙0.45-0.55g/L，FeSO4·7H2O0.08-0.12g/L，酵母膏18-25g/L；味精75-85g/L，钾盐10-18g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；其中味精单独灭菌，单独添加；所述钾盐为KCl；（4）提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4-5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，张卫，汪建英，李雪，李振海，
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12