一种生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法技术

本发明专利技术公开一种生料发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法，是利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA‑28，保藏编号为CCTCC NO：M 2012347的菌株为发酵菌株，通过菌种活化和种子液制备后，接种至生料液体发酵培养基中，在40~50℃条件下，利用廉价原料如糖蜜、味精废液、无机铵盐，分批发酵生产γ‑聚谷氨酸，发酵时间24~36h，产量最高可达50g/L。本发明专利技术提供的发酵方法，其液体发酵培养基无需高温高压灭菌，能够有效减少原料损失、显著降低生产能耗，具有生产成本低、生产效率高、工艺简单、绿色环保的优点，具备良好的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法
本专利技术属于发酵工程领域，特别涉及到一种生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
技术介绍
γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamicacid）是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键聚合而成的一种独特的生物高分子，γ-聚谷氨酸分子量可高达1,000kDa以上，其分子主链上大量游离亲水性羧基使其具有水溶性聚羧酸性质，并可作为活性位点进行广泛的化学修饰，因此赋予其强吸水保湿、絮凝性和优良的可塑性；另一方面，γ-聚谷氨酸分子主链中的酰胺键易被酶解，降解产物可被生物体吸收，因此赋予其优良的生物降解性和生物相容性，对人体和环境无毒害。这些优良生化特性使得γ-聚谷氨酸及其衍生物可广泛应用于食品、医药、化妆品、农业和环境保护等领域。γ-聚谷氨酸制备方法主要有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。化学合成法过程复杂、收率低，工业应用价值不大；酶转化法，由于酶促反应所需的谷氨酰转肽酶在生物体内含量和活力较低，且分离纯化困难，因此制约了酶转化法的发展和应用。微生物发酵法由于发酵过程容易控制、产量稳定、提取工艺简单、以及便于大规模生产等优点，是目前γ-聚谷氨酸的主要生产方法。γ-聚谷氨酸发酵生产一般采用合成培养基，pH值维持在6.5~7.5，温度30℃~40℃，但发酵过程需要在严格的无菌条件下进行，即所用菌种为纯种、发酵培养基及设备需要经过灭菌操作。然而，高压高温灭菌操作一方面需要消耗大量的能源，另一方面高压高温处理会导致原料的损耗，特别是容易促使原料中的糖类与氨基酸类发生美拉德等系列化学反应，形成大量有毒有害物质，从而抑制发酵微生物的生长，并影响发酵产物的合成。生料发酵是发酵原料不经过高温蒸煮，而直接通过微生物进行发酵。与传统熟料发酵相比，生料发酵条件温和，免除了原料的蒸煮、搅拌、输送，冷却水的使用和发酵设备的灭菌等，节省了大量的能源及成本费用从而增强产品和企业的的竞争力。目前，生料发酵在酿酒、酿醋等固态发酵过程中应用比较广泛，而液体发酵过程中应用比较少，而在液体发酵生产γ-聚谷氨酸中尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，本方法是利用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）GXA-28，保藏编号为CCTCCNO：M2012347的菌株为发酵菌株，通过菌种活化和种子液制备后，接种至生料液体发酵培养基中，在40~50℃条件下，利用廉价原料如糖蜜、味精废液、无机铵盐分批发酵生产γ-聚谷氨酸，发酵时间24~36h，产量最高可达50g/L，具有生产成本低、生产效率高、工艺简单、绿色环保的优点。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)菌种活化将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GXA-28接于固体斜面培养基上，40～45℃培养8-16h；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GXA-28的保藏编号为CCTCCNO：M2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学。（2）种子液制备一级种子制备：将上述斜面上1~3cm2的菌苔接入装有80mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速160~220rpm，40~45℃培养8-16h；二级种子制备：将一级种子液接入装有600mL液体种子培养基的3L三角瓶中，接种量1~5%（v/v），摇床转速160~250rpm，40~45℃培养8-16h。所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10~30g/L，酵母膏2~10g/L，谷氨酸钠5~20g/L，MgSO4•7H2O0.1~0.5g/L，KH2PO40.5~2g/L；pH值6.5~7.5，自来水配制，121℃高压灭菌20min。（3）液体发酵将二级种子液按接种量1~10%（v/v）接入装有生料液体发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中，发酵罐容积10~100L，装液量30~70%，搅拌转速100~600rpm，通气量0.5~3.0vvm，发酵温度40~50℃，发酵时间24~36h；所述液体发酵培养基浓度组成为：碳源10~100g/L，氮源0.5~20g/L，谷氨酸和/或谷氨酸盐10~100g/L，MgSO4•7H2O0.1~1g/L，KH2PO40.5~5g/L，KCl10~30g/L，pH值6.5~7.5，自来水配制。所述液体发酵培养基无需高温高压灭菌。所述液体发酵培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜中的任意一种或几种混合物；氮源为酵母膏、NH4Cl和(NH4)2SO4中的任意一种或几种混合物；谷氨酸盐为谷氨酸钠、市售味精和味精生产废液中的任意一种或几种混合物。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.本专利技术以枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）GXA-28，保藏编号为CCTCCNO：M2012347的菌株为发酵菌株，在40~50℃条件下，利用生料液体发酵培养基分批发酵生产γ-聚谷氨酸，发酵培养基无需高温高压灭菌，能够有效减少原料损失、显著降低生产能耗，具备良好的工业化应用前景。2.本专利技术可在生料发酵工艺条件下广泛使用廉价原料如糖蜜、味精废液、无机铵盐高效生产γ-聚谷氨酸，这些廉价原料可进一步降低发酵成本，为工业化生产提供了有利条件。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式并不局限于实施例表示的范围。实施例1～5：（1）菌种活化：将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）GXA-28接于固体斜面培养基上，45℃培养8h；固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，谷氨酸钠5g/L，MgSO4•7H2O0.1g/L，KH2PO40.5g/L，琼脂15g/L；pH值6.5，自来水配制，121℃高压灭菌20min。（2）种子液制备：一级种子制备：将上述斜面上1cm2的菌苔接入装有80mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速220rpm，45℃培养8h；二级种子制备：将一级种子液接入装有600mL液体种子培养基的3L三角瓶中，接种量5%（v/v），摇床转速220rpm，45℃培养8h。液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，谷氨酸钠5g/L，MgSO4•7H2O0.1g/L，KH2PO40.5g/L；pH值6.5，自来水配制，121℃高压灭菌20min。（3）液体发酵：将二级种子液按接种量10%（v/v）接入装有生料液体发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中，发酵罐容积10L，装液量70%，搅拌转速500rpm，通气量1vvm，发酵温度45℃，发酵时间36h；液体发酵培养基浓度组成为：碳源60g/L，酵母膏0.5g/L，NH4Cl2g/L，谷氨酸钠45g/L，MgSO4•7H2O0.2g/L，KH2PO40.5g/L，KCl20g/L，pH值6.5，自来水配制。（4）γ-聚谷氨酸产量测定：收集成熟的发酵液，加入4倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为50KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的50%，加入4倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生料发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）菌种活化：将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA‑28接于固体斜面培养基上，40~45℃培养8‑16h；（2）种子液制备：一级种子制备：将步骤（1）所述固体斜面上1~3cm2的菌苔接入装有80mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速160~220rpm，40~45℃培养8‑16h；二级种子制备：将一级种子液接入装有600mL液体种子培养基的3L三角瓶中，接种量1~5%（v/v），摇床转速160~250rpm，40~45℃培养8‑16h；（3）液体发酵：将步骤（2）所述二级种子液按接种量1~10%（v/v）接入装有生料液体发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中，发酵罐容积10~100L，装液量30~70%，搅拌转速100~600rpm，通气量0.5~3.0vvm，发酵温度40~50℃，发酵时间24~36h；所述液体发酵培养基无需高温高压灭菌。

【技术特征摘要】
1.一种生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）菌种活化：将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）GXA-28接于固体斜面培养基上，40~45℃培养8-16h；（2）种子液制备：一级种子制备：将步骤（1）所述固体斜面上1~3cm2的菌苔接入装有80mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速160~220rpm，40~45℃培养8-16h；二级种子制备：将一级种子液接入装有600mL液体种子培养基的3L三角瓶中，接种量1~5%（v/v），摇床转速160~250rpm，40~45℃培养8-16h；（3）液体发酵：将步骤（2）所述二级种子液按接种量1~10%（v/v）接入装有生料液体发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中，发酵罐容积10~100L，装液量30~70%，搅拌转速100~600rpm，通气量0.5~3.0vvm，发酵温度40~50℃，发酵时间24~36h；所述液体发酵培养基无需高温高压灭菌。2.根据权利要求1所述的生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（1）所述固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖8~12g/L，酵母膏3~6g/L，谷氨酸钠3~6g/L，MgSO4•7H2O0.1~0.2g/L，KH2PO40.3~0.5g/L，琼脂15~20g/L；pH值6.5~7.5，自来水配制，121℃高压灭菌20min...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁智群，曾伟，陈桂光，黄熙，
申请(专利权)人：广西南宁智天生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西,45