一种谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法技术

本发明专利技术提供一种谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法，本发明专利技术将黄色短杆菌与海藻酸钠溶液混匀，滴入到CaCl2溶液中固化后，再置于普鲁兰多糖溶液中成膜，得到谷氨酸产生菌活菌胶囊。然后同时接种枯草芽孢杆菌和谷氨酸产生菌活菌胶囊进行混合发酵培养。本发明专利技术采用谷氨酸产生菌活菌胶囊来发酵生产γ‑聚谷氨酸，谷氨酸产生菌活菌胶囊将谷氨酸产生菌包裹在胶囊内部，避免了发酵过程所需的两种菌直接接触，从而消除了菌种之间的相互作用，提高了发酵效率。本发明专利技术发酵方法利用谷氨酸产生菌活菌胶囊生产谷氨酸，为聚谷氨酸的发酵生产提供谷氨酸前体，因而不需要添加谷氨酸。本发明专利技术活菌胶囊可以连续发酵20次以上。

Method for producing gamma polyglutamic acid by fermentation of a glutamic acid producing bacteria capsule

The invention provides a method for producing gamma glutamic polyglutamic acid by the fermentation of glutamic acid producing bacteria capsule. The invention combines the brevis and sodium alginate solution, and drops into the CaCl2 solution to solidify, and then is placed in the pullulan polysaccharide solution to form a membrane, and the glutamic acid producing bacteria capsule is obtained. Then, the mixture of Bacillus subtilis and glutamic acid producing bacteria capsules was inoculated simultaneously. The invention uses glutamic acid producing bacteria living bacteria capsule to produce gamma glutamic polyglutamic acid. Glutamic acid producing bacteria living bacteria capsule encapsulated glutamic acid producing bacteria inside the capsule, avoiding the direct contact between the two kinds of bacteria needed in the fermentation process, thus eliminating the interaction between the strains and improving the fermentation efficiency. The fermentation method uses glutamic acid to produce glutamic acid to produce glutamic acid, which provides glutamic acid precursors for the fermentation of polyglutamic acid, and therefore does not need to add glutamic acid. The capsule can continuously ferment more than 20 times.

【技术实现步骤摘要】
一种谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种使用谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
技术介绍
γ-聚谷氨酸能溶于水、可生物降解、可食用、对人体无毒性、对环境无污染。由于其特殊的物理和化学特性，可以在食品制作中作为增稠剂、在医药行业作为药物载体、保湿剂等，广泛用于食品、医药和化妆品行业中，在农业中也可以作为保水剂，果蔬的保鲜剂、防冻剂，也可以作为水处理过程中的絮凝剂和重金属螯合剂等。由于γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由L-谷氨酸或D-谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基之间形成酰胺键生成的，因此在聚谷氨酸发酵培养基中需要加入前体物质谷氨酸。在以往的γ-聚谷氨酸发酵生产中都直接在发酵培养基中加入谷氨酸钠，由于谷氨酸用量大，转化率低，在一定程度上增加了生产成本。中国专利申请号201310755717.2(一种发酵生产高分子量γ-聚谷氨酸的方法)采用天津短杆菌与地衣芽孢杆菌混合发酵，由天津短杆菌发酵合成的谷氨酸供地衣芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸。但该方法中间需要改变培养条件，生产过程中不易控制。且两种菌混在一起培养，容易产生菌种间的相互作用，影响发酵的效率。虽然，现有技术表明微生物细胞微囊化发酵方式能够提高发酵产物的浓度、生产效率，但是目前一般只在乳酸链球菌中应用。尚未有采用谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的相关报道。
技术实现思路
本专利技术为克服现有技术中发酵生产γ-聚谷氨酸方法的不足，提供一种使用谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。本专利技术方法与现有技术相比，解决了现有技术中不能在同一条件下连续发酵的问题，提高了γ-聚谷氨酸的发酵效率；同时，本专利技术还提供一种谷氨酸产生菌活菌胶囊—黄色短杆菌活菌胶囊。为了实现上述目的，本专利技术使用谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，采用如下技术方案：(1)谷氨酸产生菌活菌胶囊的制备将黄色短杆菌与海藻酸钠溶液混匀，滴入到CaCl2溶液中固化后，再置于普鲁兰多糖溶液中成膜，得到谷氨酸产生菌活菌胶囊。(2)发酵以5％的接种量接种枯草芽孢杆菌，并同时接种5％谷氨酸产生菌活菌胶囊进行混合发酵培养，发酵时间64～72h。(3)回收谷氨酸产生菌活菌胶囊将发酵液用盐酸调pH2.5～3.5，过滤回收谷氨酸产生菌活菌胶囊，同时，向滤液中加入无水乙醇沉淀，干燥，得到聚谷氨酸粗品。具体地，本专利技术使用谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：(1)谷氨酸产生菌活菌胶囊的制备将黄色短杆菌种子液在4000～6000r/min离心3～5min，弃去上清，再加入同体积的生理盐水得菌悬液。将10～20g/L海藻酸钠溶液与黄色短杆菌菌悬液按10:1混合均匀，用一次性注射器滴入到25～35g/L搅拌着的CaCl2溶液中，固化60～120min，灭菌水冲洗，然后将其置于3～7g/L普鲁兰多糖溶液中缓慢成膜10～50min，再用0.05％普鲁兰多糖溶液覆膜3～18min，得到谷氨酸产生菌活菌胶囊。所述黄色短杆菌种子液制备方法是：将黄色短杆菌接种于装有种子培养基的三角瓶中，接种量1％，32～35℃、150r/min培养，培养至种子液OD600达到1.4～1.7。黄色短杆菌的种子培养基的组成是：葡萄糖20～30g/L，尿素3～6g/L，酵母膏2～4g/L，MgSO40.1～0.5g/L，K2HPO41～4g/L，pH7.2～7.5。(2)发酵聚谷氨酸生产菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。枯草芽孢杆菌的种子培养基组成是：葡萄糖5～10g/L，酵母粉3～5g/L，硫酸铵2～10g/L，MgSO40.1～1.0g/L，pH7.2～7.5。枯草芽孢杆菌种子液制备方法是：将枯草芽孢杆菌接种于装有种子培养基的三角瓶中，接种量1％，于32～37℃，180～220r/min摇床震荡培养至OD600达到1.8～2.2。发酵培养基：柠檬酸2～5g/L，尿素3～6g/L，蛋白胨20～40g/L，MgSO40.1～0.5g/L，K2HPO41～4g/L，葡萄糖100～200g/L，pH7.2～7.5。发酵条件：以5％的接种量接种枯草芽孢杆菌，并同接种5％谷氨酸产生菌活菌胶囊进行混合发酵培养。温度32～37℃，发酵罐条件下通气搅拌培养：转速100～300rpm、罐压0.05～0.1MPa或摇瓶振荡培养150～250r/min，发酵时间64～72h，pH不控制。(3)回收谷氨酸产生菌活菌胶囊将发酵液用盐酸调pH2.5～3.5，过滤回收谷氨酸产生菌活菌胶囊，同时，向滤液中加入无水乙醇沉淀，干燥，得到聚谷氨酸粗品。本专利技术在发酵前期利用谷氨酸产生菌活菌胶囊生产谷氨酸，为聚谷氨酸的发酵生产提供谷氨酸前体。在聚谷氨酸发酵过程中，发酵前期发酵液粘度低，营养物质和胶囊内产物谷氨酸可以透过微胶囊膜，进行胶囊内外物质交换，增加培养基中谷氨酸的含量，当谷氨酸含量达到一定浓度后，通过反馈抑制胶囊内谷氨酸的合成，同时，随着聚谷氨酸含量不断增加，发酵液粘度增加，微胶囊内外传质速率降低，进而谷氨酸发酵终止，枯草芽孢杆菌利用谷氨酸发酵生产聚谷氨酸(如图1)。本专利技术的突出优点是：(1)本专利技术首次采用谷氨酸产生菌活菌胶囊来发酵生产γ-聚谷氨酸。谷氨酸产生菌活菌胶囊将谷氨酸产生菌包裹在胶囊内部，避免了发酵过程所需的两种菌直接接触，从而消除了菌种之间的相互作用，提高了发酵效率。(2)本专利技术首次采用生物活性物质普鲁兰多糖作为活菌微胶囊的成膜剂，成膜性好，胶囊稳定性好。且该胶囊制作工艺简单，制作过程参数容易控制，发酵过程中该胶囊对菌体生长无影响，试验表明该方法的可行性较高。(3)本专利技术试验证明本专利技术活菌胶囊可以连续发酵20次以上。而且试验证明20批次的发酵产量无显著差异，可以推测得出该活菌胶囊还可以继续发酵进行发酵。现有技术中的报道的活菌胶囊，如乳酸链球菌活菌胶囊或NaCS-PDMDAAC的黄色短杆菌微胶囊，试验表明可以连续发酵12批次。本专利技术胶囊的发酵批次显著高于现有技术的活菌胶囊。所产生的显著经济效益不言而喻。(4)采用本专利技术方法发酵生产γ-聚谷氨酸，不需要额外添加谷氨酸作为发酵底物。利用谷氨酸产生菌活菌胶囊即可为聚谷氨酸发酵提供充足的谷氨酸前体。从而极大地降低了生产成本。(5)本专利技术方法在发酵过程中，不需要中途调整发酵条件，一次条件设置直至发酵结束即可。发酵结束后，从发酵液中分离出微胶囊用于下次发酵，分离采用普通的过滤就可实现。故本专利技术方法更适合工业化生产，方便快捷，操作易，成本低。附图说明图1是本专利技术谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸，发酵液中谷氨酸与γ-聚谷氨酸含量随发酵时间的变化；图中横坐标表示发酵时间，纵坐标表示谷氨酸和γ-聚谷氨酸的含量。图2是本专利技术使用谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸与现有技术直接在培养基中添加谷氨酸前体发酵生产聚谷氨酸的比较；图中横坐标表示发酵时间，纵坐标表示γ-聚谷氨酸的含量。图3是利于本专利技术谷氨酸产生菌活菌胶囊连续发酵20批次，各批次聚谷氨酸的产量；图中横坐标表示发酵批次，纵坐标表示各发酵批次的γ-聚谷氨酸产量。具体实施方式下面结合具体试验方法对本专利技术的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述。应当理解，下述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法，其特征是，方法如下：(1)谷氨酸产生菌活菌胶囊的制备将黄色短杆菌与海藻酸钠溶液混匀，滴入到CaCl2溶液中固化后，再置于普鲁兰多糖溶液中成膜，得到谷氨酸产生菌活菌胶囊；(2)发酵以5％的接种量接种枯草芽孢杆菌，并同时接种5％谷氨酸产生菌活菌胶囊进行混合发酵培养即得γ‑聚谷氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，方法如下：(1)谷氨酸产生菌活菌胶囊的制备将黄色短杆菌与海藻酸钠溶液混匀，滴入到CaCl2溶液中固化后，再置于普鲁兰多糖溶液中成膜，得到谷氨酸产生菌活菌胶囊；(2)发酵以5％的接种量接种枯草芽孢杆菌，并同时接种5％谷氨酸产生菌活菌胶囊进行混合发酵培养即得γ-聚谷氨酸。2.如权利要求1所述的谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，发酵结束后回收谷氨酸产生菌活菌胶囊：将发酵液用盐酸调pH2.5～3.5，过滤回收谷氨酸产生菌活菌胶囊，同时，向滤液中加入无水乙醇沉淀，干燥，得到聚谷氨酸粗品。3.如权利要求1所述的谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步骤(1)谷氨酸产生菌活菌胶囊的制备，具体方法是：将黄色短杆菌种子液在4000～6000r/min离心3～5min，弃去上清，再加入同体积的生理盐水得菌悬液；将10～20g/L海藻酸钠溶液与黄色短杆菌菌悬液按10:1混合均匀，用一次性注射器滴入到25～35g/L搅拌着的CaCl2溶液中，固化60～120min，灭菌水冲洗，然后将其置于3～7g/L普鲁兰多糖溶液中缓慢成膜10～50min，再用0.05％普鲁兰多糖溶液覆膜3～18min，得到谷氨酸产生菌活菌胶囊。4.如权利要求3所述的谷氨酸产生菌活菌胶囊发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述黄色短杆菌种子液的制备方法是：将黄色短杆菌接种于装有种子培养基的三角瓶中，接种量1％，32～35℃、150r/min培养，培养至种子液OD600达到1.4～1.7；所述黄色短杆菌的种子培养基的组成是：葡萄糖20～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王庆波，李海军，苏移山，张英华，谢鲁光，袁艳华，
申请(专利权)人：山东福瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37