一种ADAR1过表达病毒载体、其构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种RNA的腺苷脱氨酶1过表达病毒载体、制备方法及在所述的RNA的腺苷脱氨酶1过表达病毒载体具有保护小肠结构完整、维持肠道稳态；提高肠道巨噬细胞的活性；抑制炎性细胞因子的水平及在制备治疗脓毒症的产品中的应用。本发明专利技术所述的RNA的腺苷脱氨酶1过表达病毒载体为脓毒症的治疗提供了新的潜在的治疗靶点。

【技术实现步骤摘要】
一种ADAR1过表达病毒载体、其构建方法及应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种ADAR1过表达病毒载体，尤其是一种ADAR1过表达病毒载体、其构建方法及在保护小肠结构完整、维持肠道稳态；提高肠道巨噬细胞的活性；抑制炎性细胞因子的水平及制备治疗脓毒症的产品中的应用。
技术介绍
脓毒症(sepsis)是由感染所引起的全身炎症反应综合征，是严重创伤、烧伤及感染性疾病的常见并发症。当脓毒症继续发展合并循环功能衰竭时，病情进展为感染性休克和多器官功能障碍综合征。脓毒症发病机制复杂且病死率高，是战时创伤和急危重症医学面临的突出难题。巨噬细胞是一种多功能的免疫细胞，主要参与机体固有免疫，同时也是联系固有免疫和特异免疫的桥梁，其生物学活性主要包括：吞噬清除病菌和坏死细胞、抗原呈递和分泌炎症介质。肠道既是脓毒症病程发展过程极易损伤的器官，也是脓毒症病情恶化的始动器官，肠道细胞受损导致的肠道屏障功能障碍在脓毒症连续发生发展中具有至关重要的作用。文献Anti-cytokinetherapiesinresponsetosystemicinfection(J.Investigat.Dermatol.Sympos.Proc.6(2001)244–250)、文献Anti-cytokineandanti-inflammatorytherapiesforthetreatmentofseveresepsis:progressandpitfalls(Proc.Nutr.Soc.63(2004)437–441)和文献MiR-212-3pinhibitsLPS-inducedinflammatoryresponsethroughtargetingHMGB1inmurinemacrophages(Exp.CellRes.350(2017)318–326)公开了脓毒症时肠道巨噬细胞分泌大量炎性因子，造成肠道稳态失衡，诱发了全身性损伤。巨噬细胞的过度活化是肠道稳态失衡的关键效应细胞，巨噬细胞的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应的根本原因。RNA的腺苷脱氨酶1(ADAR1)是RNA编辑酶家族成员之一，其通过脱氨作用催化双链RNA上腺嘌呤核苷变为次黄嘌呤核苷，即A-I转换，使遗传密码发生改变，所编码的蛋白质结构和功能随之发生变化。RNA的腺苷脱氨酶1是一种特异性的修饰酶，将特殊位点上的腺苷(A)去氨基转变为次黄嘌呤(I)，核糖体解码时读作鸟嘌呤(G)，导致双链RNA核苷酸替换、相应蛋白氨基酸改变、RNA结构不稳定、50mRNA降解、依赖RNA复制的病毒遗传不稳定性等。ADAR1广泛存在于各种组织中，参与多种重要生理过程，包括胚胎发育、造血系统发育、中枢神经系统递质传递以及机体免疫等。许多研究发现RNA编辑酶在肿瘤发生发展过程中发挥着重要功能，例如文献ADAR1preventsliverinjuryfrominflammationandsuppressesinterferonproductioninhepatocytes(Am.J.Pathol.185(2015)3224–3237)公开了RNA编辑导致参与该过程信号通路中蛋白的改变。文献ADAR1activationdrivesleukemiastemcellself-renewalbyimpairinglet-7biogenesis(CellStemCell19(2016)177–191)、文献ADAR1preventsliverinjuryfrominflammationandsuppressesinterferonproductioninhepatocytes(Am.J.Pathol.185(2015)3224–3237)、和文献AdenosinedeaminasethatactsonRNA1p150inalveolarmacrophageisinvolvedinLPS-inducedlunginjury(Shock(Augusta,Ga).31(2009)410–415)中分别公开了ADAR1的炎性活性在白血病、肝损伤、肺损伤中的应用，然而目前没有发现有文献或专利公开ADAR1炎性活性与脓毒症中巨噬细胞的激活、降低炎性因子表达中的应用。脓毒症的本质是炎症介质的失控性释放和炎症反应调节失衡，导致机体自我持续性放大炎症反应进而导致机体自我破坏，其具体表现为活化的炎症细胞及过量的炎症介质通过血浆播散至远隔部位引起全身性炎症。脓毒症的诊断主要通过检测分子标志物RGL4(CN106282355A)、LETMD1(CN106367488A)或CYB561A3(CN106119402A)的水平。对于脓毒症的治疗药物，专利CN105878262A公开了连翘苷对脓毒症大鼠的治疗作用。专利CN104546832A、专利CN104784681A、专利CN105663137A、专利CN107998376、CN108025036A、CN107496441A、CN107715105A、CN108014119A、分别公开了含有3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐和冰片的药物组合物、蛋白激酶Stk38、哌仑西平、CD42b、Panx1半通道蛋白拮抗剂或一定量的Cx43半通道蛋白拮抗剂、环糊精、IL34、苯丙素糖苷SmiglasideA在制备治疗脓毒症药物中的应用。CN106924559A、CN108272971A、CN107669820A也公开了治疗脓毒症的中药配方。但是均未公开ADAR1过表达载体及在制备脓毒症治疗药物中应用。
技术实现思路
本专利技术人惊奇的发现，删除巨噬细胞中的RNA的腺苷脱氨酶1(ADAR1)后，不仅导致细胞快速死亡而且使得炎症恶化。随即，经过创造性劳动，制备ADAR1过表达病毒载体，调控机体内源性ADAR1酶的活性显著提高脓毒症小鼠的存活。将本专利技术所述的ADAR1过表达病毒载体应用到脓毒症治疗产品中。产生了降低TNF-α、IL-6、IL-10及IFN-β炎性因子的表达，特别是IL6和TNF；保证了小肠结构完整，肠道内稳态失衡的好转；提高肠道巨噬细胞的活性；并显著提高脓毒症小鼠的存活率的作用。本专利技术所述的RNA的腺苷脱氨酶1过表达病毒载体为脓毒症的治疗提供了新的潜在的治疗靶点。同时，本专利技术所述的ADAR1过表达病毒载体的制备方法，采用RNAi的靶点序列对ADAR1过表达病毒载体中的核酸序列进行同义突变，在靶向操作过程中避免脱靶现象的发生。本专利技术提供了一种RNA的腺苷脱氨酶1过表达病毒载体、其构建方法及应用。ADAR1主要是通过IFN信号及内质网应激反应，促进免疫细胞浸润，肠道炎症反应进一步促进了小肠黏膜促炎因子IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α等的表达，ADAR1是肠道巨噬细胞免疫功能的关键调控点，ADAR1可以增加前体microRNA被Dicer酶切割的速率，并能促进microRNA装载到RNA诱导沉默复合物上加工编辑microRNA。本专利技术公开了一种RNA的腺苷脱氨酶1过表达病毒载体，所述的载体包括RNA的腺苷脱氨酶1过表达核酸序列，所述RNA的腺苷脱氨酶1过表达核酸序列选自NCBI登录号NM_001146296.1或与NM_001146296.1序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA的腺苷脱氨酶1过表达病毒载体，其特征在于，所述的载体包括RNA的腺苷脱氨酶1过表达核酸序列，所述RNA的腺苷脱氨酶1过表达核酸序列选自NCBI登录号NM_001146296.1或与NM_001146296.1序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％同源性的序列。

【技术特征摘要】
1.一种RNA的腺苷脱氨酶1过表达病毒载体，其特征在于，所述的载体包括RNA的腺苷脱氨酶1过表达核酸序列，所述RNA的腺苷脱氨酶1过表达核酸序列选自NCBI登录号NM_001146296.1或与NM_001146296.1序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％同源性的序列。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的病毒载体为PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。3.一种RNA的腺苷脱氨酶1过表达病毒载体的构建方法，其特征在于，所述的载体包括RNA的腺苷脱氨酶1过表达核酸序列，所述RNA的腺苷脱氨酶1过表达核酸序列选自NCBI登录号NM_001146296.1或与NM_001146296.1序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％同源性的序列。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的与NM_001146296.1序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊杰，刘善收，谢建刚，赵彬，尹文，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61