腺病毒的热灭活方法技术

本发明专利技术总体涉及在热灭活期间保护含有AAV颗粒和辅助病毒颗粒的样品中AAV病毒颗粒基因组完整性和/或生物活性的方法。所述方法包括将含有辅助病毒颗粒、AAV颗粒和缓冲液的样品加热到45℃以上的温度。所述缓冲液包括浓度10mM以上的亲液盐和/或浓度10mM以上的二价或三价阳离子。

Thermal inactivation of adenovirus

The invention generally relates to a method for protecting genomic integrity and/or biological activity of AAV virus particles in samples containing AAV particles and auxiliary virus particles during thermal inactivation. The method includes heating samples containing auxiliary virus particles, AAV particles and buffer solution to temperatures above 45 C. The buffer comprises a hydrophilic salt with a concentration of more than 10 mM and/or a divalent or trivalent cation with a concentration of more than 10 mM.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺病毒的热灭活方法相关申请的交叉引用本申请要求于2016年3月28日提交的美国临时申请序列号62/314,116的优先权的权益，题为“腺病毒的热灭活方法”，其全部内容通过引用整体并入本文所述。
技术介绍
腺相关病毒(AAV)是一种无致病性、有复制缺陷的细小病毒。AAV载体具有许多独特的特征，使得它们作为在基因治疗载体时具有吸引力。具体的，AAV载体能够将治疗基因递送到分裂和非分裂的细胞，并且这些基因可以持续较长时间而不整合到目标细胞的基因组中。然而，为了制备AAV载体，必须提供辅助病毒功能，有时以活性感染病毒诸如腺病毒(AV)的形式提供。为分离出治疗性AAV载体，在AAV载体纯化过程中必须使辅助病毒颗粒失活。然而，常用的辅助病毒灭活方法，例如热灭活，也可导致AAV载体基因组的破坏或降解，从而降低可从灭活过程中恢复的AAV载体的质量和数量。这对较大的AAV载体基因组而言更是如此。因此，需要在本领域开发出一个在辅助病毒灭活过程中保护AAV载体完整性的方法。
技术实现思路
本专利技术总体涉及在热灭活时在含有AAV颗粒和辅助病毒颗粒的样品中保护AAV病毒颗粒基因组完整性和/或生物活性的方法。这些方法通常通过对辅助病毒颗粒的影响大于其对AAV颗粒的影响，得以选择性地灭活辅助病毒颗粒。所述方法包括将含有辅助病毒颗粒、AAV颗粒和缓冲液的样品加热到大于或等于45℃的温度。所述缓冲液包括浓度大于等于10mM的亲液盐和/或浓度大于等于10mM的二价或三价阳离子。所述方法包括将样品加热至大于或等于45℃、大于或等于46℃、大于或等于47℃、大于或等于48℃、大于或等于49℃、大于或等于50℃、或大于或等于51℃的温度。在某些实施例中，样品被加热至45℃和65℃之间、45℃和60℃之间、45℃和55℃之间、47℃和53℃之间、48℃和51℃之间、或48℃和50℃之间的温度。例如，在某些实施例中，样品被加热至48℃和50℃之间、或至48℃或49℃。加热样品的时间可以变化。例如，在某些实施例中，样品加热至目标温度1分钟到6小时之间，诸如10至180分钟之间、20至180分钟之间、20至60分钟之间、或20至40分钟之间。通常的，较高温度或加速辅助病毒颗粒灭活的其他条件与相对短暂的加热时间结合使用，反之亦然。在一些方法中使用了含有浓度10mM以上的二价或三价金属阳离子的缓冲液。示例性阳离子包括下述金属的阳离子：形成如Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Sr2+、Cu2+、Cr2+和Sc3+的阳离子的Mg、Ca、Mn、Ni、Zn、Co、Sr、Cu、Cr、Fe和Sc。在某些实施例中所述缓冲液包含浓度10mM以上的Mg2+和/或Ca2+。在一组含有浓度10mM以上的二价或三价金属阳离子的缓冲液中，浓度大于15mM。例如，阳离子浓度可以大于20mM，大于50mM，大于100mM，或大于200mM。在另一组含有浓度10mM以上的二价或三价金属阳离子的缓冲液中，浓度是从10mM至500mM。例如，阳离子浓度可以从20mM至400mM，30mM至300mM，50mM至250mM，70mM至200mM，或浓度为50mM、100mM、150mM或200mM。在某些方法中使用了含有浓度10mM以上的亲液盐的缓冲液。示例性亲液盐包括硫酸铵、乙酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸钠、磷酸钾和氯化铯，它们可以单独使用或以任何组合使用。如果存在的话，亲液盐通常以超过10mM的浓度使用，如在0.1M和1M之间；在0.2M和0.8M之间；在0.3M和0.7M之间；在0.4M和0.6M之间；或0.5M。在某些方法中，使用的缓冲液含有离液盐。在一组含有离液盐的缓冲液中，离液盐是尿素盐或胍盐。在某些方法中，使用的缓冲液含有多元醇。在一组含有多元醇的缓冲液中，多元醇是甘油、丙二醇或1，6-己二醇。在某些方法中，缓冲液在4℃和70℃之间的温度范围内可保持pH值。一组缓冲液在4℃和70℃的温度之间内可保持pH值在3.0和10.0之间。另一组缓冲液在4℃和70℃的温度之间内可保持pH值在7.0和9.0之间。在某些方法中，缓冲液为tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、三唑胺缓冲液或1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷(BIS-TRISpropane)缓冲液。在一组tris和1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷缓冲液中，缓冲液包含附加成分，包括HEPES、柠檬酸盐(citrate)、NaCl和普朗尼克(Pluronic)F68。在一组1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷缓冲液中，缓冲液包含40mM1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mMHEPES、20mM柠檬酸盐、200mMNaCl、和0.001％(重量体积比w/v)普朗尼克F68。本文公开的方法可用于保存任何AAV颗粒的基因组完整性。在一些方法中，AAV颗粒包括大约4.7kb的DNA、大于4.7kb的DNA、大于5.0kb的DNA或大约5.1kb的DNA的基因组。或者，AAV颗粒可以包括小于4kb的DNA，或约3kb的DNA的基因组。本文所公开的方法可以与单链或基本自身互补的基因组的AAV颗粒一起使用。本专利技术的灭活方法可使活性辅助病毒的对数去除率大于5.0。一组该种方法使辅助病毒的对数去除率达到大于6或大于6.3。在某些方法中，辅助病毒会是腺病毒、疱疹病毒或杆状病毒。在一组所述方法中，其中辅助病毒是腺病毒，所述腺病毒是Ad5。附图说明图1示出了显示Ad5的病毒对数去除率(LRV)作为暴露温度和暴露温度下所花费时间的函数的等高线图。用Ad5感染试验测定Ad5颗粒的灭活水平。实际数据点用黑点表示，在所述数据点之间插入等值线图。该试验中LRV的定量限定为6.3。大于6.3的去除率为不可测得。图2示出了显示各种AAV产物的得率作为暴露温度和暴露温度下所费时间的函数的等高线图。图2A示出了HEK293制备的hu37血清型截短产物的结果，图2B示出了HeLa制备的hu37血清型超大产物的结果，图2C示出了HEK293制备的AAV8血清型单链产物的结果，以及图2D示出了HEK293制备的AAV8血清型自身互补产物的结果。用DNA酶抗性颗粒qPCR(DRP-qPCR)试验测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。实际数据点用黑点表示，在所述数据点之间插入等值线图。图3示出了使用DRP-qPCR法(暗条)和TCID50感染性试验(亮条)测定的回收率结果的比较。测试的样品与图2B所示的20分钟的曝光时间的相同。“对照”是在整个实验中保持冰冻的加载样品。图4示出了两种AAV产物的得率作为暴露温度和暴露温度下所费时间的函数的等高线图。图4A示出了HeLa制备的hu37血清型超大产物的结果，图4B示出了HEK293制备的hu37血清型超大产物的结果。使用DRP-qPCR法测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。实际数据点用黑点表示，在所述数据点之间插入等值线图。图5示出了HEK293制备的hu37血清型超大产物在不同背景缓冲液中的得率作为暴露温度和暴露温度下所费时间的函数的等高线图。图5A示出了40mM1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mMHEPES、20mM柠檬酸盐、200mMNaCl、0.001％(w/v)普朗尼克F68、pH8.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在含有辅助病毒颗粒、腺相关病毒颗粒和缓冲液的样品中灭活辅助病毒的方法，该方法包括：将样品加热至温度大于或等于45℃，其中缓冲液包含浓度为10mM以上的二价或三价阳离子，或浓度为10mM或以上的亲液盐。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.28 US 62/314,1161.一种在含有辅助病毒颗粒、腺相关病毒颗粒和缓冲液的样品中灭活辅助病毒的方法，该方法包括：将样品加热至温度大于或等于45℃，其中缓冲液包含浓度为10mM以上的二价或三价阳离子，或浓度为10mM或以上的亲液盐。2.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至45℃和65℃之间的温度。3.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至45℃和60℃之间的温度。4.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至45℃和55℃之间的温度。5.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至47℃和53℃之间的温度。6.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至48℃。7.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至49℃。8.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度1分钟至6小时之间的时间。9.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度10至180分钟之间的时间。10.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度20至180分钟之间的时间。11.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度20至60分钟之间的时间。12.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度20至40分钟之间的时间。13.如权利要求1所述的方法，其中所述方法导致辅助病毒的对数去除率为6.3以上。14.如权利要求1所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含大于4.7kb的DNA的基因组。15.如权利要求1所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含约5.1kb的DNA的基因组。16.如权利要求1中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含约4.7kb的DNA的基因组。17.如权利要求1中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含约4.0kb的DNA的基因组。18.如权利要求1中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含约3.0kb的DNA的基因组。19.如权利要求1中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含基本上自身互补的基因组。20.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液还包含离液盐。21.如权利要求20所述的方法，其中所述离液盐是尿素盐。22.如权利要求20所述的方法，其中所述离液盐是胍盐。23.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液还包含选自甘油、丙二醇和1，6-己二醇的多元醇。24.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液在4℃和70℃之间的温度维持pH在3.0和10.0之间。25.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液在4℃和70℃之间的温度维持pH在7.0和9.0之间。26.如权利要求1中所述的方法，其中所述缓冲液还包含：40mM1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mMHEPES、20mM柠檬酸盐、200mMNaCl和0.001w/v％(重量体积比)普朗尼克F68。27.如权利要求24所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托弗·J·默里森，詹姆士·D·马雷特，
申请(专利权)人：维度治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US