包含GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物制造技术

本发明专利技术涉及包含GM‑CSF基因、Flt3L‑TRAIL融合基因、抑制TGF‑β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物
本专利技术涉及包含GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物。
技术介绍
粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)以各种方式起作用，首先其用于聚集抗原提呈细胞，例如天然杀伤细胞或树突细胞。此外，已知GM-CSF刺激肿瘤周围的树突细胞，从而增加共刺激分子的表达，使得CD4+和CD8+T细胞增强免疫反应，并且除了促进树突细胞分化之外，在原代单核细胞中参与对MHCII类分子组成的分子的表达的调节[J.Immunol.171:2374byHornelletal.,2003.RegulationoftheclassIIMHCpathwayinprimaryhumanmonocytesbygranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor]。此外，已知当GM-CSF在肿瘤中表达时，在肿瘤周围收集APC，并且通过有效治疗肿瘤抗原来强烈诱导抗癌免疫应答[CancerImmunol.Immunother.53:17byPanetal.,2004Insiturecruitmentofantigen-presentingcellsbyintratumoralGM-CSFgenedelivery]。通过共表达的Flt3-L和TRAIL，FLT3L-TRAIL具有双重功能，例如，对树突细胞从DC祖细胞增殖成DC的有效刺激(FLT3L)，和对癌细胞的凋亡的诱导(TRAIL)。当DC获得源自凋亡肿瘤体的抗原时，可以实现对肿瘤的有吸引力的疫苗接种。该方法可以触发广泛的CD4+和CD8+T细胞应答，而无需鉴定肿瘤特异性抗原表位。因此，无论HLA单倍型如何，该方法适用于所有癌症患者[Mol.Ther.3:368byWuetal.,2001.RegressionofhumanmammaryadenocarcinomabysystemicadministrationofarecombinantgeneencodingthehFlex-TRAILfusionprotein.；Mol.Ther.9:674byWuandHui,2004.InductionofpotentTRAIL-mediatedtumoricidalactivitybyhFLEX/furin/TRAILrecombinantDNAconstruct]。本专利技术人已经获得了关于抑制TGF-β1或TGF-β2和HSP27表达的shRNA的专利[韩国专利第1286053、1420564和1374585号]。已经熟知的是，HSP27的免疫作用通过由于HSP27沉默而增加蛋白组学活性来增加由CD8+T细胞介导的肿瘤坏死和记忆应答。在这点上，还没有通过使用GM-CSF和FLT3L-TRAIL来制备有机复合体从而将同时抑制TGF-β和HSP表达的shRNA应用于抗肿瘤治疗的研究。
技术实现思路
[技术问题]因此，本专利技术人尝试开发一种抗肿瘤基因组合物，其具有通过同时增加肿瘤特异性细胞毒性作用和免疫活性以及肿瘤免疫原性而最大化的抗肿瘤活性，因此证实，当使用共表达抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)的基因递送系统来将该基因组合物转导到靶细胞时，与表达每种基因或甚至表达GM-CSF或Flt3L-TRAIL时比较，抗肿瘤效果得到较大改善，并且还证实，当使用共表达GM-CSF基因、Flt3L-TRAIL融合基因、shTGF-β和shHSP的基因递送系统将该基因组合物转导到靶细胞时，与表达每种基因特别是表达shTGF-β和shHSP时相比，显示出更高的抗肿瘤效果。由此，完成了本专利技术。[技术方案]为此，本专利技术指向提供共表达GM-CSF、FLT3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP-的基因递送系统以及包含所述基因递送系统的抗肿瘤组合物，所述基因递送系统包括GM-CSF基因、FLT3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。此外，本专利技术指向提供共表达shTGF-β和shHSP的基因递送系统以及包含所述基因递送系统的抗肿瘤组合物，所述基因递送系统包括抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。作为解决上述问题的手段，本专利技术提供一种共表达GM-CSF、FLT3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP的基因递送系统，其包括GM-CSF基因、flt3-L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。作为解决上述问题的另一种手段，本专利技术提供一种抗肿瘤药物组合物，其包含GM-CSF基因、FLT3L-TRAIL融合基因、抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。作为解决上述问题的又另一种手段，本专利技术提供一种共表达shTGF-β和shHSP的基因递送系统，其包括抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。作为解决上述问题的再另一种手段，本专利技术提供一种抗肿瘤组合物，其包含抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。[有益效果]在本专利技术中，由于使用shRNA介导的RNA干扰作用于TGF-β(其为导致疾病发作的一种蛋白质)肿瘤相关基因上，抑制TGF-β的表达，以限制诱导免疫耐受的因素并诱导由GM-CSF诱导的免疫加强应答，增强抗肿瘤作用，表达Flt3L-TRAIL，同时抑制TGF-β和HSP表达，从而显著增强癌症疾病动物模型的抗肿瘤效果。包括这些融合基因的总共四种单独基因的结合，而不是简单地具有抗肿瘤功能的基因随机组合，使得这些基因彼此紧密且有机地互相关联。附图说明图1展示根据本专利技术的包括在重组腺病毒载体中的四个基因的单独的作用方式；图2展示本专利技术的四个基因具有有机和协同的关系而非其独立作用以显示抗癌作用；图3示出根据本专利技术的二种型重组腺病毒载体和四种型重组腺病毒载体(YSC-02和YSC-01)；图4A示出Flt3L-TRAIL插入具有SalI/BamHI的Adlox载体中；图4B示出Flt3L-TRAIL插入具有XbaI和MfeI的pIRES载体中；图4C示出Flt3L-TRAIL插入具有PmeI的pVAX1-3484-CMVp-ΔE1B(-E1R)穿梭载体中；图4D示出表达人Flt3L-TRAIL的溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒通过以dl324-BstBI作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-ΔE1B-Flt3L-TRAIL作为穿梭载体进行同源重组制备而成；图5A示出表达人shTGF-β的溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒通过以dl324-BstBI-U6-shTGF-β1作为骨架并且以pVAX1-3484-CMVp-ΔE1B作为穿梭载体进行同源重组制备而成；图5B示出表达人shTGF-β的溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于共表达粒细胞‑巨噬细胞刺激因子(GM‑CSF)、Flt3L‑TRAIL、shTGF‑β和shHSP的基因递送系统，所述基因递送系统包括：GM‑CSF基因；Flt3L‑TRAIL融合基因；抑制TGF‑β表达的shRNA(shTGF‑β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.08 KR 10-2015-01738581.一种用于共表达粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、Flt3L-TRAIL、shTGF-β和shHSP的基因递送系统，所述基因递送系统包括：GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL融合基因；抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。2.权利要求1所述的基因递送系统，其特征在于，所述GM-CSF基因由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2表示。3.权利要求1所述的基因递送系统，其特征在于，所述Flt3L-TRAIL融合基因由SEQIDNO：3表示。4.权利要求1所述的基因递送系统，其特征在于，所述shTGF-β是shTGF-β1或shTGF-β2。5.权利要求4所述的基因递送系统，其特征在于，所述shTGF-β1由SEQIDNO：4或SEQIDNO：5表示。6.权利要求4所述的基因递送系统，其特征在于，所述shTGF-β2由SEQIDNO：6或SEQIDNO：7表示。7.权利要求1所述的基因递送系统，其特征在于，所述shHSP是shHSP25或shHSP27。8.权利要求7所述的基因递送系统，其特征在于，所述shHSP25由SEQIDNO：8表示。9.权利要求7所述的基因递送系统，其特征在于，所述shHSP27由SEQIDNO：9表示。10.权利要求1所述的基因传递系统，其特征在于，所述基因递送系统是质粒、重组腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、脂质体或类脂囊泡。11.权利要求10的基因递送系统，其特征在于，所述基因递送系统是重组腺病毒载体。12.一种用于肿瘤治疗的药物组合物，包含权利要求1-11中任一项所述的基因递送系统。13.一种用于肿瘤治疗的药物组合物，包含：GM-CSF基因；Flt3L-TRAIL融合基因；抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。14.权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述GM-CSF基因由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2表示。15.权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述Flt3L-TRAIL融合基因由SEQIDNO：3或SEQIDNO：4表示。16.权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述shTGF-β是shTGF-β1或shTGF-β2。17.权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，所述shTGF-β1由SEQIDNO：5或SEQIDNO：6表示。18.权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，所述shTGF-β2由SEQIDNO：7或SEQIDNO：8表示。19.权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述shHSP是shHSP25或shHSP27。20.权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述shHSP25由SEQIDNO：8表示。21.权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述shHSP27由SEQIDNO：9表示。22.权利要求12或13所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物改善免疫活性和免疫原性。23.权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述基因或shRNA由一种或多种基因递送系统引入。24.一种基因递送系统，包含抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)以共表达shTGF-β和shHSP。25.权利要求24所述的基因递送系统，其特征在于，所述shTGF-β是shTGF-β1或shTGF-β2。26.权利要求25所述的基因递送系统，其特征在于，所述shTGF-β1由SEQIDNO：5或SEQIDNO：6表示。27.权利要求25所述的基因递送系统，其特征在于，所述shTGF-β2由SEQIDNO：7或SEQIDNO：8表示。28.权利要求24所述的基因递送系统，其特征在于，所述shHSP是shHSP25或shHSP27。29.权利要求28所述的基因递送系统，其特征在于，所述shHSP25由SEQIDNO：8表示。30.权利要求28所述的基因递送系统，其特征在于，所述shHSP27由SEQIDNO：9表示。31.权利要求24所述的基因递送系统，其特征在于，所述基因递送系统是质粒、重组腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、脂质体或类脂囊泡。32.权利要求31所述的基因递送系统，其特征在于，所述基因递送系统是重组腺病毒载体。33.一种用于肿瘤治疗的药物组合物，包含权利要求24-32中任一项所述的基因递送系统。34.一种用于肿瘤治疗的药物组合物，包含抑制TGF-β表达的shRNA(shTGF-β)和抑制HSP表达的shRNA(shHSP)。35.权利要求34所述的药物组合物，其特征在于，所述shTGF-β是shTGF-β1或shTGF-β2。36.权利要求35所述的药物组合物，其特征在于，所述shTGF-β1由SEQIDNO：5或SEQIDNO：6表示。37.权利要求35所述的药物组合物，其特征在于，所述shTGF-β2由SEQIDNO：7或SEQIDNO：8表示。38.权利要求34所述的药物组合物，其特征在于，所述shHSP是shHSP25或shHSP27。39.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋在真，韩哲洙，康东旭，许蓉，崔慧真，
申请(专利权)人：延世大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR