一种LRFFT1细胞的构建方法技术

本发明专利技术使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点进行抗原表位预测，连接并合成突变多肽表达基因序列；同时构建慢病毒载体，包装慢病毒，转染APC细胞，完成特异性LV细胞的改造，体外与从外周血中分离的PBMC共培养，筛选出有效多肽，通过精准有效多肽刺激的第二次冲击，将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的RFF细胞；再利用TCR－T技术原理进行了改造；改造后的T细胞再用基因编缉技术对其进行免疫抑制靶点的敲除，精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，得到更为攻防兼备的LRFFT1细胞。

Construction of LRFFT1 cells

The invention uses human peripheral blood for ctDNA sequencing or full exon sequencing of tumor tissue, screens mutation sites for antigen epitope prediction, links and synthesizes mutation polypeptide expression gene sequence, constructs lentivirus vector, packages lentivirus, transfects APC cells, completes transformation of specific LV cells, co-cultures in vitro with PBMC separated from peripheral blood, and screens out PBMC with lentivirus vector, packaging lentivirus and transfecting APC cells. Effective polypeptide, through the second shock of precise effective polypeptide stimulation, transforms ordinary T cells into RFF cells with more precise killing ability; then transforms them by TCR-T technology principle; after transformation, T cells are knocked out by gene coding technology, which precisely protects specific killing T cells from in vivo inhibition and improves T cells'tumorigenesis. The lethality of the tumor cells can obtain more offensive and defensive LRFFT1 cells.

【技术实现步骤摘要】
一种LRFFT1细胞的构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种LRFFT1细胞的构建方法。
技术介绍
目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术，靶向递呈MAGEA3抗原。以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤免疫微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递呈和共培育，但靶点单一(MAGE-3)，仅对非小细胞肺癌等个别癌种起效。虽然也有尝试慢病毒为载体的方法进行转染递呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而简单混合多肽的直接刺激，虽然简单方便，但效率较低。特异性精准多肽的二次刺激不如T细胞受体转导的肿瘤特异性抗原更直接。现有的TCR-T在治疗血液肿瘤和实体肿瘤的解决方案中，缺乏覆盖更多瘤种的精准的TCR。上述方案均没有考虑T细胞的自我防护技术，使得数量不多的特异性T细胞直接面对强大的肿瘤免疫微环境。普遍缺乏对患者抗原也缺乏准确有效的分析。
技术实现思路
本专利技术使用患者外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点进行抗原表位预测，连接并合成突变多肽表达基因序列；同时构建慢病毒载体，包装慢病毒，转染APC细胞，完成特异性LV细胞的改造，体外与从外周血中分离的PBMC共培养，筛选出有效多肽，通过精准有效多肽刺激的第二次冲击，将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的RFF细胞；再利用TCR－T技术原理进行了改造；改造后的T细胞再用基因编缉技术对其进行免疫抑制靶点的敲除，精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，得到更为攻防兼备的LRFFT1细胞。本专利技术提供的LRFFT1细胞可广泛应用于个体化精准治疗实体肿瘤。对于专用名词的解释：L：慢病毒转染技术R：精准多肽二次冲击技术FF：混合多肽技术T：TCR-T技术1：靶点敲除防护技术例如：LRFFT1细胞，即经由上述L、R、FF、T、1各项技术方案或技术手段改造而最终获得的细胞。LRFFT1细胞改造方案概述如下：1、抗原表位预测1)使用人源外周血进行ctDNA测序或市售工程细胞系(如H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-25394T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞等)进行MHC类型检测和全外显子测序检测RNA突变；2)利用MHC类型和基因突变信息预测抗原表位：以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位；3)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；2、多肽连接1)使用前述软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，可以连接；IC50＜1000nM时认为是强免疫原性，不能连接；2)根据上述结果，将弱免疫原性的抗原表位连接在一起，接头处IC50要高于两侧抗原表位的IC50(也就是接头处尽量避免产生强结合抗原)；3、合成编码多肽的基因序列1)将连接后的多肽还原为核酸序列，并进行密码子优化；2)使用固相合成法合成抗原表位肽的基因序列；或由技术服务公司进行合成；4、慢病毒包装将上步合成的基因序列构建表达抗原表位肽的慢病毒表达质粒后，进行慢病毒包装；5、转染抗原递呈细胞(APC)并与PBMC共培养1)使用表达抗原表位肽的慢病毒转染抗原递呈细胞(包括但不限于：外周血单个核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞)；2)收集处理完成的APC，以APC：PBMC＝1：5-20的比例混合共培养，得到效应细胞；6、筛选有效的精准多肽，并使用精准多肽再次刺激T细胞1)离心收集以上方案获得的T细胞，多肽作为抗原直接刺激T细胞筛选精准多肽：2)设置阳性对照：T细胞+100ng/mLOKT3；阴性对照：T细胞+1640+10％FBS+200U/mLIL2；3)精准多肽评判标准：a.阳性对照和阴性对照正常，则说明此数据可信；b.实验组显著大于阴性对照组的为有效的精准多肽；4)以筛选出的精准多肽二次冲击T细胞；7、构建TCR-T细胞1)对刺激后的T细胞进行CD8、CD137、IFN-γ的染色，并以流式细胞仪进行分选；2)分选出能够识别精准多肽的特异性细胞，测序确定高频TCR序列并扩增；3)构建TCR基因表达载体，包装病毒；4)敲除所述外周血T细胞中原有的TCR基因，转入上步构建的TCR基因，培养即得TCR-T细胞；8、敲除细胞表面免疫抑制性信号分子，即得LRFFT1细胞细胞表面抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、2B4(CD244)；9、构建特异性抗原表达靶细胞及肿瘤模型生存实验。本专利技术的有益效果：1.肿瘤抗原为突变抗原，与其它组织不同，靶点专一性强，不易发生脱靶效应，安全性高；2.获得的特异性细胞比例高，通常能够识别肿瘤抗原的特异性细胞，在PBMC的分布为0.5％以下，经过LRFFT1方案改造的细胞，识别肿瘤抗原的特异性T细胞(TCR+)比例为50％以上；3.LRFFT1细胞由于对PD1、CTLA4、TIM3、LAG3等免疫抑制性靶点进行敲除，因此，对肿瘤的杀伤能力不受限制，杀伤效率更高。附图说明图1：慢病毒转染APC效率检测；其中，1A：对照组，1B：转染组。图2：LFF细胞分型检测。图3：精准多肽的筛选。图4：流式检测特异性T细胞比例；其中，4A：对照组，4B：LRFF方案。图5：TCR分布频率。图6：抑制性靶点的敲除情况；其中，6A：敲除前，6B：敲除后。图7：原有TCR的敲除效率检测；其中，7A：敲除前，7B：敲除后。图8：特异性TCR的表达效率；其中，8A：转染前，8B：转染7天后。图9：LDH释放检测杀伤效率。图10：ELISA检测细胞因子IFN-γ的释放。图11：动物荷瘤模型生存曲线。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。技术方案详述如下：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤如下：1)使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点；2)根据突变位点进行抗原表位预测，合成突变多肽的基因序列；3)构建表达突变多肽的慢病毒载体，包装慢病毒；4)转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得LFF细胞；4)所述突变多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，筛选出有效的精准多肽；5)以所述精准多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，测序并得到特异性细胞的高频TCR基因；6)敲除外周血T细胞中原有的TCR基因，转入上步获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，获得TCR‑T细胞；7)敲除细胞表面免疫抑制性信号分子，即得LRFFT1细胞。

【技术特征摘要】
1.一种LRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤如下：1)使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点；2)根据突变位点进行抗原表位预测，合成突变多肽的基因序列；3)构建表达突变多肽的慢病毒载体，包装慢病毒；4)转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得LFF细胞；4)所述突变多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，筛选出有效的精准多肽；5)以所述精准多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，测序并得到特异性细胞的高频TCR基因；6)敲除外周血T细胞中原有的TCR基因，转入上步获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，获得TCR-T细胞；7)敲除细胞表面免疫抑制性信号分子，即得LRFFT1细胞。2.如权利要求1所述的LRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述人源外周血也可以是市售工程细胞系...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，张天赋，周子珊，宋玉洁，陈小彬，吴子明，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11