制备免疫缺陷的大鼠的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及制备免疫缺陷的大鼠的方法及其应用。本发明专利技术人利用新的方法，构建获得了新型的免疫缺陷大鼠。应用所述的免疫缺陷大鼠，本发明专利技术人进一步建立了肝细胞、肿瘤细胞等细胞移植模型。本发明专利技术的免疫缺陷大鼠具有良好的应用前景。

Method of preparing immunodeficient rats and its application

The invention relates to a method for preparing immunodeficient rats and its application. The inventor has constructed and obtained a new type of immunodeficient rat by using a new method. Using the immunodeficient rat, the human of the invention further establishes the transplantation model of hepatocytes, tumor cells and other cells. The immunodeficient rat has good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
制备免疫缺陷的大鼠的方法及其应用
本专利技术属于生物学领域，更具体地，本专利技术涉及制备免疫缺陷的大鼠的方法及其应用。
技术介绍
肝脏疾病是威胁人类健康的重要疾病之一，尤其是肝炎病毒引发的肝炎、肝硬化和肝癌以及疟原虫导致的疟疾影响人类健康并造成严重经济负担。肝脏疾病的发病机制及治疗极其复杂，而且人肝细胞体外培养后迅速失去肝特性。因此除了细胞水平，更需要借助动物模型从机体水平进行相关研究。但嗜肝性病原体具有高度的宿主特异性，只能感染人和少数高等灵长类动物(如黑猩猩等)的肝细胞，导致无法在小鼠等传统动物模型中进行相关肝脏疾病研究。通过人肝细胞移植后重构免疫缺陷动物肝脏，可以建立肝脏人源化动物。一种肝脏人源化动物构建方法为：首先从肝脏供体中分离原代肝细胞，然后移植到带有肝损伤的免疫缺陷动物模型(如uPA-SCID小鼠)中。经过6-8周再殖，人肝细胞重构了小鼠肝脏。根据血清中人血清白蛋白的分泌量，确定整合比例高的人源化小鼠，用于后续药物代谢、安全性和肝炎病毒感染。肝脏人源化小鼠的肝脏代谢酶和转运体表达和功能已被证实与人类肝脏几乎一致。此前HBV药物非阿尿苷因严重肝毒性导致5人死亡而在临床II期失败。但在狗、猴、大鼠、小鼠实验中并未发现其有肝脏毒性。当用非阿尿苷处理肝脏人源化小鼠，在低剂量情况下就能导致肝损伤，并能产生病人所有临床症状和病理包括肝功能严重受损、脂肪肝和肝细胞线粒体破坏。因此肝脏人源化动物在临床前进行药物代谢、药物相互作用和安全性评价中具有应用前景。1990年Brinster实验室构建了Alb-uPA小鼠。这种小鼠出生后会出现严重甚至致死的肠及腹腔出血。JoergPetersen实验室将Alb-uPA小鼠与Rag2-/-免疫缺陷小鼠交配获得了uPA/Rag2-/-小鼠。通过人肝细胞脾脏移植，首次获得再殖比例达(15％)的肝脏人源化小鼠。通过抑制补体反应及选取增殖能力强的人肝细胞，KatsutoshiYoshizato实验室在uPA/SCID小鼠中实现了极高比例(>90％)的人肝细胞再殖。在该高再殖比例肝脏人源化小鼠中，人代谢酶的表达及诱导都和人肝脏非常接近。但是，目前Alb-uPA小鼠模型存在以下问题：第一，新生小鼠的死亡率很高，子代近半数于产后4天内死于腹腔或内脏出血，移植的窗口期很短(需在出生后2周内移植)；第二，存活的小鼠中仅部分是uPA基因携带者，而且部分小鼠还存在转基因失活的问题；第三，移植的人肝细胞分泌的补体，对小鼠肾脏功能产生损伤，进一步增加了死亡率。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetatehydrolase，FAH)基因剔除小鼠(简称Fah-/-小鼠)于1993年建立。Fah-/-小鼠因不能进行完全的酪氨酸代谢而在肝脏中积累丁二酰，从而造成肝实质细胞的死亡。在饮用水中添加NTBC饲养的Fah-/-小鼠与野生型小鼠表型无明显区别、肝功能正常并可正常发育和繁殖，但在停止喂食NTBC后将在4～6周内因肝功能衰竭而死亡。Fah-/-小鼠存在广泛而持续的肝损伤，其肝脏微环境特别适合于移植细胞的增殖，野生性肝细胞(FAH基因表达正常)经脾脏移植后几乎可以完全重建Fah-/-小鼠的肝脏(90％以上)，受体小鼠恢复正常的肝功能。将Fah-/-小鼠和Rag2-/-IL2rg-/-免疫缺陷小鼠杂交后，获得三基因敲除的Fah-/-Rag2-/-IL2rg-/-小鼠(FRG小鼠)。FRG小鼠缺少成熟的T、B细胞及NK细胞，当移植人肝细胞后，可以获得很高程度(>90％)的人肝细胞再殖。HiroshiSuemizu实验室应用新的可诱导肝损伤小鼠模型—ThymidineKinase-Nod/SCID/IL2rg-/-(TK-NOG小鼠)，可构建高比例(>90％)肝脏人源化小鼠。在Nod/SCID/IL2rg-/-小鼠(NOG小鼠)基础上用Alb启动子在肝脏中特异表达I型单纯疱疹病毒的胸苷激酶(herpessimplexvirustype1thymidinekinase)。通过给小鼠注射GCV，该化合物对正常细胞无害，但在表达TK基因的小鼠肝细胞中被代谢成有毒产物而造成肝细胞死亡，为移植的人肝细胞提供再殖空间。这种小鼠得益于其免疫缺陷的程度，人肝细胞的平均再殖比例比Alb-uPA/SCID小鼠和FRG小鼠高。但这种免疫缺陷小鼠仅能通过人工受精进行繁殖、饲养环境清洁要求极高，难以推广使用。SuLishan实验室建立了肝脏及免疫系统双人源化小鼠模型，在Balb/c背景的Rag2-/-IL2rg-/-小鼠基础上，利用Alb启动子在肝脏中特异表达FK506结合蛋白(FKBP)和半胱天冬酶8(Caspase8)的融合蛋白。通过注射AP20187诱导FKBP形成二聚体进而激活Caspase8，导致小鼠自身肝细胞发生凋亡，与此同时促进人肝细胞的再殖。从流产胎儿胚肝中分离人肝祖细胞和CD34+造血干细胞，将这两组细胞分别注射到出生1-5天经辐射的新生小鼠肝脏，建立了肝脏及免疫系统人源化的小鼠(AFC8-huHSC/Hep)。该小鼠不仅支持HCV病毒感染，并能产生人T细胞介导的免疫应答。并且，首次发现HCV感染可以在小鼠中诱导肝炎和肝纤维化，同时伴随着星状细胞的活化和人纤维发生相关基因的表达。但考虑到免疫排斥，该模型必须使用流产胎儿的胚肝作为实验材料来获得同一个体来源的肝细胞和造血干细胞，存在伦理问题。另外，相对低的人肝细胞再殖比例(10-30％)和肝祖细胞的相对不成熟性，是该模型的缺陷。大鼠作为中等大小实验动物比小鼠大了10倍以上，易于手术操作，也可以提供更多的生物材料用于实验分析；大鼠在生理和病理方面与人类更接近，被更广泛地应用于检测药物治疗效果和毒性测试。因此，大鼠成为肝脏人源化动物研究领域的研究热点。如能获得肝脏人源化大鼠，其相对小鼠将更具有应用前景，特别是在药物研发领域。另一方面，虽然肝脏人源化小鼠可作为生物反应器生产人肝细胞，但每只小鼠只能生产出8～15×107肝细胞，数量低。而理论上一只肝脏人源化大鼠可以获得109数量级的人肝细胞，以有效缓解人肝细胞来源匮乏的问题。因此肝脏人源化大鼠相对于小鼠更适合作为人肝细胞的生物反应器。同时目前肝脏人源化小鼠构建的最大成本之一也在于人肝细胞，导致其售价达到每只小鼠3500美元。而由肝脏人源化大鼠提供大量人肝细胞，将极大地降低肝脏人源化动物的构建成本，促进其更广泛的应用。近年来，Rag1/2-/-、IL2rg-/-和Prkdc-/-IL2rg-/-等多种免疫缺陷大鼠被相继报道。但这些免疫缺陷大鼠主要是利用Zinc-finger核酸酶、TALEN等技术构建完成，成本高且手续繁杂，而且它们存在繁殖困难的问题特别是Prkdc-/-IL2rg-/-大鼠存在早衰现象，导致不利于推广和产业利用。目前利用Rag1-/-免疫缺陷大鼠，人原代肝细胞可以在大鼠肝脏中达到10％再殖比例。这说明类似小鼠，肝脏人源化大鼠的构建也是可能的。但该模型主要受限于以下两方面：1)Rag1-/-大鼠仍残留T细胞，而且NK细胞相对野生型甚至更多。使用免疫抑制手段能降低免疫排斥，但不能彻底去除，而且费用极高；2)采用注射retrorsine结合肝切的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备免疫缺陷的大鼠的方法，其特征在于，包括：破坏重组激活基因2和白介素2受体γ基因；从而获得免疫缺陷的大鼠。

【技术特征摘要】
2017.06.16 CN 20171045869701.一种制备免疫缺陷的大鼠的方法，其特征在于，包括：破坏重组激活基因2和白介素2受体γ基因；从而获得免疫缺陷的大鼠。2.一种制备大鼠细胞的方法，其特征在于，包括：破坏大鼠重组激活基因2和白介素2受体γ基因；较佳地，所述的细胞为受精卵。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括：破坏大鼠延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，破坏延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因的第2外显子；破坏重组激活基因2的第3外显子；破坏白介素2受体γ基因的第2外显子；较佳地，利用Crispr/Cas9基因编辑法进行所述的破坏。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，利用靶向于延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因的第2外显子的sgRNA以及Cas9mRNA来破坏延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因的第2外显子；较佳地，所述的sgRNA是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示核苷酸序列的sgRNA。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，利用靶向于重组激活基因2的第3外显子的sgRNA以及Cas9mRNA来破坏重组激活基因2的第3外显子；较佳地，所述的sgRNA是SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示核苷酸序列的sgRNA。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，利用靶向于白介素2受体γ基因的第2外显子的sgRNA以及Cas9mRNA来破坏白介素2受体γ基因的第2外显子；较佳地，所述的sgRNA是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示核苷酸序列的sgRNA。8.如权利要求5～7任一所述的方法，其特征在于，将所述的sgRNA以及Cas9mRNA或能够形成该sgRNA以及Cas9mRNA的构建物引入到大鼠的受精卵内；使受精卵...

【专利技术属性】
技术研发人员：惠利健，张鲁狄，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31