人源化CD40基因改造动物模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种CD40基因人源化动物模型构建的方法及应用。本发明专利技术还保护一种能够特异的靶向CD40基因的sgRNA序列、一种制备多基因人源化动物模型的方法以及相关应用。本发明专利技术提供了一种适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，一种新的人源化动物模型制备方法，有利于相关疾病的研究，为生物医学实验的开展提供了有效的技术手段。本发明专利技术还涉及人源化基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化CD40基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Preparation and Application of Humanized CD40 Genetically Modified Animal Model

The invention discloses a method for constructing humanized animal model of CD40 gene and its application. The invention also protects a sgRNA sequence that can specifically target CD40 gene, a method for preparing a polygenic humanized animal model and related applications. The invention provides a tool mouse suitable for transplantation of human cells or tissues, a new method for preparing humanized animal model, which is beneficial to the study of related diseases, and provides an effective technical means for the development of biomedical experiments. The invention also relates to humanized genetically modified non-human animals, especially genetically modified rodents, but in particular to genetically modified mice, in particular to the construction method of humanized CD40 gene animal model and its application in the field of biomedicine.

【技术实现步骤摘要】
人源化CD40基因改造动物模型的制备方法及应用
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化CD40基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化动物模型(humanizedanimalmodel)是动物模型未来的重要发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因序列替换动物基因组的同源基因序列，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升异种细胞或组织移植生长的效率，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达部分或全部人源蛋白，可作为识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(ScheerNetal.DrugDiscovToday；18(23-24):1200-11,2013)。免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是近年来肿瘤研究的一个重要领域。目前和肿瘤免疫治疗相关的一些药物已经用于治疗，已有药品上市并应用在多个适应症，如靶向T细胞共刺激分子CTLA-4、PD-1及其配体的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的平均应答率较低，且单一的免疫治疗策略治疗效果有限，在临床中一般需要结合两种或多种免疫治疗手段进行。开发更多可以用于提高免疫系统对肿瘤识别及杀伤能力的药物一直是免疫学研究的热点之一。CD40是一种糖基化的I型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族(TNF-R)成员，广泛表达于多种细胞表面，包括免疫细胞(如B细胞、单核细胞和树突状细胞等)和非免疫细胞(如上皮细胞、内皮细胞、间质细胞、血小板等)。进一步的研究发现CD40在肿瘤细胞中也有广泛表达，在肿瘤早期因其凋亡前活性和引起免疫反应的能力能阻止肿瘤的发生，但肿瘤晚期由于免疫防御的丧失，CD40可促进肿瘤血管的生成，反而促进与肿瘤侵润和转移有关基因的表达。其配体CD40L(又称CD154)是一种II型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族(TNF)成员，CD40L主要存在于活化的CD4+T细胞表面。CD40-CD40L作为体内特异性免疫反应系统重要的一对共刺激分子，在体液免疫和细胞免疫中均起着重要作用，不仅在B细胞、树突状细胞的分化、成熟中有重要作用，而且在多种细胞因子的产生、表达中也起着重要作用。研究表明CD40-CD40L信号途径与多种免疫疾病相关，包括X连锁高免疫球蛋白M综合症、动脉粥样硬化、炎症性肠病、睡眠呼吸暂停综合征、川崎病和肿瘤等。体外试验和动物模型都已证实抗CD40抗体通过阻断CD40与CD40L的相互作用及其产生的免疫反应，或与其它共刺激信号通路联合阻断、或联合DST或西罗莫司的使用，可有效的抑制器官移植中的排斥反应(董红梦等，器官移植，2016年7月第7卷第4期)，并可减轻或治疗多种自身免疫性疾病(MarxN.etal.Circulation.2003Apr22；107(15):1954-7)；而CD40抗体激动剂则能有效激活体内的抗肿瘤免疫反应(FransenMFetal.，ClinCancerRes.2011Apr15；17(8):2270-80；SandinLC.etal.CancerImmunolRes.2014Jan；2(1):80-90；QiCJ.etal.CellImmunol.2009；259(2):135-40.)，与已有的免疫检查点药物联合使用在能够更好地引起抗肿瘤免疫反应(AlexanderL.,etal.JImmunol.2017Feb15；198(4):1575-1584)。目前已有与CD40相关的动物模型主要是Cd40基因缺陷小鼠。最早是Kawabe等人(1994年)为了研究Cd40在体内免疫应答中的作用，通过传统胚胎干细胞技术破坏小鼠体内Cd40基因的3号外显子，制备了C57BL/6背景的Cd40缺陷小鼠，并在该小鼠体内观察到成熟B细胞表面CD23表达显著降低，对胸腺依赖的抗原反应中，仅有IgM抗体产生，没有IgG、IgA和IgE抗体，且生发中心形成有缺陷，表明Cd40在T细胞依赖性免疫球蛋白转换和生发中心形成是必需的。进一步的研究发现Cd40缺陷小鼠极易感染利什曼原虫属和雷克氏锥虫，显示了CD40/CD40L相互作用对细胞内寄生虫病原体的保护性免疫应答的关键作用(Kamanaka,Masahitoetal.Immunity,Volume4,Issue3,275–281；Soong,Lynnetal.Immunity,Volume4,Issue3,263-273)。Cd40缺陷小鼠及与其它品系或基因修饰模型交配得到的少数Cd40缺陷小鼠模型，主要应用于Cd40基因的生物学功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制研究(PasareCetal.Nature.2005Nov17；438(7066):364-8；，IfeomaOkworetal.JImmunolOctober1,2015,195(7)3218-3226；ScottMJ.etal.ClinExpImmunol137(3):469-77；SunJCetal.,JImmunol172(6):3385-9)。在CD40靶点相关药物研发过程中，由于啮齿类如小鼠的Cd40蛋白与人CD40蛋白在氨基酸序列上同源性为61％左右，所以，一般情况下识别人CD40蛋白的抗体，无法识别小鼠Cd40，即无法用普通啮齿动物模型来筛选和评价靶向人源CD40药物的药效('tHartBAetal.，NeurodegenerDis.2008；5(1):38-52)。目前研究靶向药物的药效广泛使用的是人源肿瘤异体移植小鼠模型，但该类模型在特定靶点研究中的靶向性和特异性不强，且所使用的异体移植的小鼠是免疫缺陷小鼠，由于激动性抗CD40抗体的主要机制原理是激活宿主APC，特别是树突状细胞，以诱导机体的抗肿瘤T细胞应答(BeattyGL,etal.Science2011；331:1612–6；LumHDetal.JLeukocBiol2006；79:1181–92)，因此这类模型研究药效的结果准确性不高。此外，还有通过转基因的方式将人CD40基因转入小鼠体内，建立转基因小鼠模型用于抗体研究，但转基因技术制备的小鼠存在诸多缺点，如插入位点的不确定性、插入拷贝数的不确定性、蛋白表达量不稳定以及后代的转基因遗传的不稳定性，从而造成实验数据的不可重复性及基因遗传丢失等等问题，而不能被广泛使用。(MangsboSMetal.ClinCancerRes,2015Mar1；21(5):1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括人CD40基因，该人源化动物模型体内可表达人或人源化CD40蛋白，同时内源CD40的蛋白表达降低或缺失。

【技术特征摘要】
2017.06.19 CN 2017104645644;2017.09.25 CN 201710871.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括人CD40基因，该人源化动物模型体内可表达人或人源化CD40蛋白，同时内源CD40的蛋白表达降低或缺失。2.根据权利要求1所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合CD40基因，所述嵌合CD40基因编码人源化CD40蛋白，所述人源化CD40蛋白的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述嵌合CD40基因编码的胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述嵌合CD40基因编码的胞外区域包含人CD40蛋白胞外域的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Cd40启动子后；优选的，所述嵌合CD40基因的跨膜区为动物来源。3.根据权利要求2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，其中所述动物来源部分包括Cd40基因的1号外显子全部序列、7号外显子部分序列及其后所有外显子的全部序列；和/或所述人CD40基因部分为第2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子和/或第7号外显子的部分或全部序列。4.根据权利要求1-3任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行CD40人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行CD40人源化动物的构建。5.根据权利要求4所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，其中所述动物来源的Cd40基因为啮齿类动物来源的Cd40基因；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。6.根据权利要求5所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，将动物来源的Cd40的第2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子和/或7号外显子全部或部分序列替换为人源CD40的第2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子和/或7号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQIDNO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQIDNO：8-14任一项所示；优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：8。7.根据权利要求1或2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述的嵌合CD40蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述胞外区域包含人CD40蛋白的全部或部分片段，所述跨膜区为动物来源；优选的，所述人源化CD40蛋白为嵌合CD40蛋白，所述的嵌合CD40蛋白选自下列组中的一种：a)嵌合CD40蛋白序列为SEQIDNO：27所述氨基酸序列的部分或全部；b)嵌合CD40蛋白序列与SEQIDNO：27所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)编码嵌合CD40蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQIDNO：27所示蛋白的核苷酸序列杂交；d)嵌合CD40蛋白序列与SEQIDNO：27所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；e)嵌合CD40蛋白序列具有SEQIDNO：27所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。8.根据权利要求7所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合CD40基因，所述嵌合CD40基因编码权利要求7所述的嵌合CD40蛋白，或所述的嵌合CD40基因选自下列组中的一种：a)嵌合CD40基因为SEQIDNO：24所示的序列的部分或全部；b)嵌合CD40基因的CDS序列为SEQIDNO：25所示的序列的部分或全部；c)嵌合CD40基因的mRNA序列为SEQIDNO：26所示的序列的部分或全部；d)嵌合CD40基因序列与SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；e)嵌合CD40基因的序列在严格条件下，与SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的核苷酸序列杂交；f)嵌合CD40基因的序列与SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；g)嵌合CD40基因序列具有SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或h)嵌合CD40基因中来源于人CD40基因的部分为SEQIDNO：30所示的序列的部分或全部；i)嵌合CD40基因中来源于人CD40基因的部分为与SEQIDNO：30所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；j)嵌合CD40基因中来源于人CD40基因的部分在严格条件下，与SEQIDNO：30所示的核苷酸序列杂交；k)嵌合CD40基因中来源于人CD40基因的部分为与SEQIDNO：30所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；l)嵌合CD40基因中来源于人CD40基因的部分为具有SEQIDNO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。9.一种权利要求1-8任一所述的方法构建的人源化动物模型或其后代，其特征在于，所述的人源化动物模型或其后代表达嵌合CD40蛋白。10.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000068.7至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000068.7至少具有90％同源性的核苷酸。11.根据权利要求10所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于Cd40基因的第2外显子至第7外显子。12.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述5’臂序列如SEQIDNO：28所示；所述3’臂序列如SEQIDNO：29所示。13.根据权利要求10-12任一所述的靶向载体，其特征在于，其中替换的供体DNA序列片段来自人；优选的，替换的供体DNA序列为人CD40基因的核苷酸序列部分或全部；进一步优选的，所述人CD40基因的核苷酸序列包括人CD40基因DNA序列的第2外显子至第7外显子的全部或部分。14.根据权利要求13所述的靶向载体，其特征在于，所述人CD40基因的核苷酸序列选自NCBI登录号为NC_000020.11的第46121826-46128154位核...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，郭朝设，黄蕤，赵磊，郭雅南，白阳，张美玲，姚佳维，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11