用于特异性修复人HBB基因突变的碱基编辑系统、方法、试剂盒及其在人生殖系中的应用技术方案

本发明专利技术提供了一种用于在人生殖系内特异性修复人HBB基因突变的方法，包括：递送用于特异性修复人HBB基因突变的碱基编辑系统，使所述的碱基编辑系统与人HBB突变基因相关的序列接近，获得经过修复的人HBB基因，其中，所述的碱基编辑系统包含碱基编辑酶和gRNA，所述碱基编辑酶为融合蛋白，所述融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、胞嘧啶脱氨酶结构域以及尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂结构域。将该基因编辑系统导入到人的生殖细胞、人的受精卵或人的胚胎中，可以对A＞G致病突变进行精确的修复，从而治愈β地中海贫血疾病，该技术在基因治疗领域，具有广泛的应用前景。

Base Editing System, Method and Kit for Specific Repair of Human HBB Gene Mutation and Its Application in Human Reproductive System

The invention provides a method for specifically repairing human HBB gene mutation in human reproductive system, including: delivering a base editing system for specifically repairing human HBB gene mutation, making the base editing system close to the sequence related to human HBB mutation gene, and obtaining the repaired human HBB gene. The base editing system includes base editing enzymes and gRNA. The base editing enzyme is a fusion protein, which includes the effector protein domain of CRISPR/Cas system, the cytosine deaminase domain and the uracil DNA glycosylase inhibitor domain. By introducing this gene editing system into human germ cells, human fertilized eggs or human embryos, the pathogenic mutation of A > G can be accurately repaired, thus curing beta thalassemia. This technology has a wide application prospect in the field of gene therapy.

【技术实现步骤摘要】
用于特异性修复人HBB基因突变的碱基编辑系统、方法、试剂盒及其在人生殖系中的应用
本专利技术涉及基因检测及基因修饰领域，涉及一种用于特异性修复人HBB基因突变的碱基编辑系统、方法、试剂盒及其在人生殖系中的应用。
技术介绍
规律成簇间隔短回文重复系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas)是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的获得性免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA或RNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能；第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9，Cpfl，C2cl等)来发挥功能。其中，Cas9，Cpfl，C2cl均具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性。目前，Cas9和Cpfl蛋白作为基因组编辑工具被广泛应用，克服了传统基因编辑技术步骤繁琐、耗时长、效率低等缺点，以其较少的成分、便捷的操作以及较高的效率满足了大多数领域的基因编辑需求，并有着潜在且巨大的临床应用价值。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR-Cas9是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strandbreaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologousendjoining，NHEJ)，造成移码突变(frameshiftmutation)，导致基因敲除。CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。CRISPR/Cas9系统是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑，它主要包含Cas9和RNA两部分。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA——crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA(chimericRNA)，简称sgRNA(smallguideRNA)。crRNA-tracrRNA的二聚体以及sgRNA都能作为向导RNA(guideRNA，gRNA)，介导CRISPR/Cas9系统的寻靶。另外，CRISPR/Cas9介导的DNA定点切割还需要靶位点附近的对各个CRISPR/Cas系统来说都相对保守的PAM(Protospaceadjacentmotif)序列的辅助，才能识别与gRNA引导序列互补的靶DNA。针对靶位点设计gRNA，Cas9蛋白就会在gRNA的指引下寻找靶DNA，并切割靶DNA。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒(供体DNA分子)，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中通过同源重组精确地引入定点突变或者外源片段的定点插入。随着研究的深入，CRISPR/Cas技术已经被广泛的应用。除了基因敲除，基因替换等基础编辑方式，它还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。虽然，CRISPR/Cas9技术的出现，极大地提高了基因定点突变的效率，但目前依然无法满足临床治疗的需要。最近，依托于CRISPR/Cas9技术，科学家开发了新一代的基因编辑技术——碱基编辑技术。碱基编辑系统是由Cytidinedeaminase：Cas9：UGI融合蛋白(碱基编辑酶)和gRNA两部分组分组成的精确基因编辑技术5-7。Cytidinedeaminase：Cas9：UGI的融合蛋白中的Cas9通过与gRNA结合，并利用gRNA的序列，通过碱基互补配对，将融合蛋白靶向到靶DNA上，然后，碱基编辑酶会利用其中的Cytidinedeaminase(胞嘧啶脱氨酶)的酶活性将靶DNAd的4-8位中的C(胞嘧啶)转变成尿嘧啶(Uridine，U)，UGI是尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UracilDNAglycosylaseinhibitor，UGI)，其通过抑制U的切除，导致DNA在复制时U与A(腺嘌呤，Adenine)配对，然后再通过DNA复制，使得U变成T(Thymine，胸腺嘧啶)，从而最终将C转变成T5，6，8。碱基编辑技术介导的DNA定点突变比通过同源重组技术介导的突变效率高100倍以上，在部分小鼠受精卵中甚至能够达到100％的定点突变效率。根据碱基编辑酶中Cas9是否能够切割靶DNA，将碱基编辑酶命名为Baseeditor2(BE2)或者Baseeditor3(BE3)，其中BE2完全不能切割双链靶DNA，而BE3能将双链靶DNA中的靶向链(Targetstrand)切开。因此，碱基编辑系统能否做到特异性、精确靶向目标基因的靶碱基是碱基编辑系统能否特异地进行基因的定点突变的先决条件。其中，碱基编辑系统的特异性主要决定于Cas9以及gRNA。通过对Cas9进行定点突变，从而降低Cas9与双链靶DNA的靶向链(Targetstrand)或非靶向链(Non-targetstrand)磷酸骨架的非特异性相互作用可以提高特异性。另外，设计、制备并筛选能特异地与靶DNA互补的gRNA也是决定碱基编辑系统效率和特异性的关键因素。地中海贫血是由红细胞血球蛋白合成异常导致的遗传疾病。患者的红细胞比正常的红细胞更小且更脆弱，非常容易破裂，导致溶血性贫血。另外，其携氧能力也比正常细胞弱，导致全身各个组织缺氧。成年人的血球蛋白包含HbA2(2.5％)，HbF(0.5％)和HbA(97％)三种类型。其中占比最大的HbA蛋白由2个α球蛋白亚基和两个β球蛋白亚基组成1。根据突变亚基的不同，地中海贫血又可以分为α地中海贫血和β地中海贫血。其中β地中海贫血是由血球蛋白β球蛋白亚基突变导致的一种常见单基因遗传疾病，其编码基因为HBB(humanβglobin)1。HBB的突变使得β球蛋白合成减少或者变得不稳定，导致血球蛋白中α球蛋白和β球蛋白的比值失衡，血球蛋白减少，进而影响红细胞的成熟，导致成熟的红细胞数目减少。另外，积累在红细胞中的α球蛋白及其降解产物，会导致红细胞裂解。两种因素叠加在一起，共同导致贫血2。按照症状的严重程度来分，β地中海贫血可以分为：微型β地中海贫血、中型β地中海贫血和重型β地中海贫血。重型β地中海贫血患者通常在1岁左右出现严重贫血、生长发育停滞、骨骼异常以及肝脾肿大。另外，由于红细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在人生殖系内特异性修复人HBB基因突变的方法，其特征在于，包括：递送用于特异性修复人HBB基因突变的碱基编辑系统，使所述的碱基编辑系统与人HBB突变基因相关的序列接近，获得经过修复的人HBB基因，其中，所述的碱基编辑系统包含碱基编辑酶和gRNA，所述碱基编辑酶为融合蛋白，所述融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、胞嘧啶脱氨酶结构域以及尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂结构域。

【技术特征摘要】
1.一种用于在人生殖系内特异性修复人HBB基因突变的方法，其特征在于，包括：递送用于特异性修复人HBB基因突变的碱基编辑系统，使所述的碱基编辑系统与人HBB突变基因相关的序列接近，获得经过修复的人HBB基因，其中，所述的碱基编辑系统包含碱基编辑酶和gRNA，所述碱基编辑酶为融合蛋白，所述融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、胞嘧啶脱氨酶结构域以及尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂结构域。2.如权利要求1所述用于在人生殖系内特异性修复人HBB基因突变的方法，其特征在于，所述gRNA包含15-100个核苷酸，并且还包括与靶DNA序列互补的至少12个连续核苷酸组成的引导序列。3.如权利要求1或2所述用于在人生殖系内特异性修复人HBB基因突变的方法，其特征在于，所述的gRNA的引导序列包括SEQIDNO.1-SEQIDNO.93所示核苷酸序列中的一种或多种。4.如权利要求1或2所述用于在人生殖系内特异性修复人HBB基因突变的方法，其特征在于，所述的gRNA为如下1)或2)中的一种：1)包括crRNA和tracrRNA，其中，crRNA的部分序列与tracrRNA的部分序列互补、并组成二聚体，其中，crRNA的引导序列包括SEQIDNO.1-SEQIDNO.93所示核苷酸序列中的一种或多种；2)嵌合型单链sgRNA，其中sgRNA由crRNA与tracrRNA融合而成，sgRNA的引导序列的包括SEQIDNO.1-SEQIDNO.93所示核苷酸序列中的一种或多种。5.如权利要求1所述用于在人生殖系内特异性修复人HBB基因突变的方法，其特征在于，所述碱基编辑酶的氨基酸序列包括与SEQIDNO.94-105所示氨基酸序列至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％一致的序列。6.如权利要求1所述用于在人生殖系内特异性修复人HBB基因突变的方法，其特征在于，所述的碱基编辑酶融合蛋白中，CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域与胞嘧啶脱氨酶结构域之间还连接有第一连接肽。7.如权利要求1所述用于在人生殖系内特异性修复人H...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄军就，松阳洲，梁普平，孙宏伟，张曦亚，孙英，丁晨晖，徐艳文，周灿权，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44