制备ROSA26基因突变及肌内脂肪提高的动物的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备ROSA26基因突变及肌内脂肪提高的动物的方法。本发明专利技术提供了突变ROSA26基因的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括靶向ROSA26基因的sgRNA，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1。该方法通过向受体细胞中导入sgRNA和Cas9以及含有PPARγ基因表达盒的供体DNA实现ROSA26基因的定点整合。实验证明，利用本发明专利技术的方法可以成功于ROSA26基因位点定点整合PPARγ2基因，最终成功得到表达PPARγ2的动物。

Preparation of ROSA26 Gene Mutation and Intramuscular Fat Increase in Animals

The invention discloses a method for preparing ROSA26 gene mutation and intramuscular fat enhancement animal. The present invention provides a method for mutating ROSA26 gene by using CRISPR/Cas9 system, which includes sgRNA targeting ROSA26 gene and the target sequence of sgRNA is SEQ ID No.1. By introducing sgRNA and Cas9 into receptor cells and donor DNA containing PPAR gamma gene expression cassette, this method can achieve the site-specific integration of ROSA26 gene. Experiments show that the method of the present invention can successfully integrate PPAR gamma 2 gene at ROSA26 locus, and ultimately successfully obtain animals expressing PPAR gamma 2.

【技术实现步骤摘要】
制备ROSA26基因突变及肌内脂肪提高的动物的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种制备ROSA26基因突变及肌内脂肪提高的动物的方法。
技术介绍
对世界上大多数国家而言，猪肉是动物蛋白的主要来源。随着猪肉品质越来越受到人们的关注，肉质改良已成为目前猪育种工作的重点。影响猪肉质性状的因素很多，但肌内脂肪(IMF)含量目前被认为是最重要的肌肉品质性状指标之一，它与肉的嫩度和风味有直接关系，是非常重要的经济性状。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorsγ，PPARγ)是细胞核激素受体家族的一种活性配体转录蛋白，主要在脂肪组织、血管平滑肌以及巨噬细胞中表达，其中脂肪组织表达最高，研究表明PPARγ在脂肪细胞分化和成熟、脂肪酸的吸收储存以及脂肪沉积的关键因子。大量研究表明在动物生产中，PPARγ是脂肪沉积和肉品质形成的重要影响因子，PPARG与动物肌内脂肪含量相关，是影响畜禽肌肉内脂肪含量的主效候选基因，猪PPARγ基因编码1.8KbmRNA，与人、牛和小鼠PPARγ具有高度同源性，相似性分别为99％、97和96本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.突变ROSA26基因的方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括靶向ROSA26基因的sgRNA，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1。

【技术特征摘要】
1.突变ROSA26基因的方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括靶向ROSA26基因的sgRNA，所述sgRNA的靶序列为SEQIDNo.1。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：向受体细胞中导入所述sgRNA和Cas9，实现ROSA26基因的突变。3.根据权利要求书2所述的方法，其特征在于：所述“向受体细胞中导入所述sgRNA和Cas9”是通过将含有所述sgRNA的表达载体和含有Cas9的表达载体导入所述受体细胞中实现的。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述“含有所述sgRNA的表达载体”和所述“含有Cas9的表达载体”为同一载体，将该载体命名为载体1，所述载体1为通过BbsI酶切位点向CRISPR/Cas9载体中插入SEQIDNo.1所示DNA片段后得到的重组载体，所述载体1能表达权利要求1所述的sgRNA和Cas9。5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括向所述受体细胞中导入供体DNA的步骤；所述供体DNA含有ROSA26基因中位于所述靶序列上下游的两段DNA片段；进一步地，位于所述靶序列上游的DNA片段的序列为SEQIDNo.2的第825-1810位；位于所述靶序列下游的DNA片段的序列为SEQIDNo.2的第6514-8076位。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述供体DNA还含有PPARγ2编码基因或PPARγ2编码基因表达盒；进一步地，所述PPARγ2编码基因表达盒自5’端到3’端依次包括MCK启动子、PPARγ2编码基因，以及polyA终止信号序列；更进一步地，所述供体DNA的序列为SEQIDNo.2。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：左波，顾浩，李嘉楠，徐在言，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42