一种RFFT2细胞的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种RFFT2细胞的构建方法，属于生物技术领域。该方法用于构建一种用于细胞免疫治疗的RFFT2细胞，是一种攻防一体、精准性高、杀伤性高的T细胞。该构建方法包括以下步骤：PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击；冲击后扩大培养，得到FF细胞；以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激FF细胞以筛选精准多肽；培养PBMC细胞，在培养过程中，用精准多肽进行多肽冲击；冲击后继续培养，得到RFF细胞；筛选获得能够识别所述精准多肽的特异性细胞；由特异性细胞获取TCR基因；培养PBMC细胞，敲除原有的TCR基因，并转入前述所获取的TCR基因，制备得到RFFT细胞；用单抗药对前述所得RFFT细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，得到RFFT2细胞。

A Method of Constructing RFFT2 Cells

The invention provides a method for constructing RFFT2 cells, which belongs to the field of biotechnology. This method is used to construct RFFT2 cells for cell immunotherapy. It is a T cell with high accuracy and killing ability. The construction method includes the following steps: PBMC cells are loaded with mutagenic polypeptides and then impacted with polypeptides; FF cells are expanded after impacting, so that the mutant polypeptides can be used as antigens to directly stimulate FF cells to screen precise polypeptides; PBMC cells are cultured and subsequently impacted with precise polypeptides in the process of culture; RFF cells were further cultured to obtain RFF cells; specific cells were screened to identify the precise polypeptide; TCR gene was obtained from specific cells; PBMC cells were cultured to knock out the original TCR gene and transferred into the TCR gene obtained above to prepare RFFT cells; RFFT2 cells were obtained by blocking the immunosuppressive signal molecules of the aforementioned RFFT cells with monoclonal antibodies.

【技术实现步骤摘要】
一种RFFT2细胞的构建方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种RFFT2细胞的构建方法。
技术介绍
肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，它从病人体内采集免疫细胞，然后进行体外培养和扩增，再回输到病人体内，来激发以及增强机体的自身免疫功能以治疗肿瘤。肿瘤细胞免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。正常或生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者体内，新输入的细胞可以替代受损细胞、或者具有更强的免疫杀伤功能，从而达到治疗疾病的目的。生物工程改造过的细胞用特殊方法在体外培养过程中加以改造，可有效杀除患者体内肿瘤细胞。如，中国专利申请CN201210194280.5提供了一种人细胞因子诱导的杀伤细胞。中国专利申请CN201510034781.0提供一种肿瘤细胞特异性多克隆T细胞。中国专利申请CN201510013987.5提供一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。中国专利申请CN201711060030.1提供一种治疗艾滋病合并淋巴瘤的CAR-T细胞及其制备方法和应用。CN201610824893.0提供一种抗体调控的双抗原特异性T细胞及其制备方法和应用。现有技术中，一般是通过DC细胞递呈T细胞，产生特异杀伤的T细胞，或者用病毒做为载体，通过慢病毒转染技术诱导T细胞的特异性杀伤。但要么由于肿瘤抗原不明和肿瘤微环境免疫抑制的障碍，致使效果不佳；要么由于让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤微环境，因而导致效果不佳，要么靶点单一，只对个别肿瘤有效。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种RFFT2细胞的构建方法，构建一种新的TCR-T细胞(命名为RFFT2细胞)，用于细胞免疫治疗，实现了查杀的精准性、特异性和安全性。本专利技术提供一种RFFT2细胞的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)培养PBMC细胞，在培养过程中，用精准多肽进行多次多肽冲击；S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；S6)以精准多肽作为抗原刺激所得RFF细胞，筛选获得能够识别所述精准多肽的特异性细胞；S7)通过测序得到特异性细胞的TCRβ链CDR3区序列，由所述TCRβ链CDR3区序列扩增得到TCR基因；S8)培养PBMC细胞，敲除细胞中原有的TCR基因，并转入步骤S7中获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，制备得到RFFT细胞；S9)用单抗药对步骤S8所得RFFT细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，以得到RFFT2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。进一步地，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养，得到FF细胞组合物包括：将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养5天；转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养至第10天；转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养至第14～21天。进一步地，步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。进一步地，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL～100μg/mL的多肽溶液进行多肽冲击。进一步地，多肽冲击的冲击时间1-4h。进一步地，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：1)外显子测序对肿瘤细胞进行全外显子测序；将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；2)抗原表位预测以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，得到一段21个氨基酸的多肽，以此作为潜在抗原表位；IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；3)合成多肽采用多肽固相合成法合成抗原表位肽。进一步地，所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-25394T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。进一步地，在步骤S8之前，构建敲除TCR基因的CRISPR慢病毒载体，以其感染由PBMC细胞通过磁珠分选的CD8+T细胞，用于制备RFFT细胞。进一步地，步骤S9包括以培养液OKM-200+5％FBS将步骤S8所得RFFT细胞进行重悬，而后加入终浓度为50～200μg/mL的抑制性信号分子的单抗药，37℃封闭1h，得到RFFT2细胞。本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术提供了一种新的细胞构建方法，以构建一种用于细胞免疫治疗的TCR-T细胞(命名为RFFT2细胞)，是一种攻防兼备的超级T细胞。在构建过程中，通过筛选出有效的精准多肽并将其对PBMC细胞进行二次多肽冲击。需要注意的是，在二次精准多肽冲击中采用加量的多肽冲击刺激。而后在两次刺激的基础上，联合TCR-T技术进行第三次刺激，将普通T细胞改造为更有特异杀伤作用的T细胞，杀伤效率高、精准性高。2)在本专利技术中，同时联合体外封闭、体外培养和体外扩增实现了查杀的精准性、特异性和安全性，覆盖更多瘤种，提高具有高精准性杀伤作用的T细胞对复杂的肿瘤微环境的适应力。3)本专利技术通过联合多肽刺激和TCR-T技术诱导T细胞的杀伤作用，与直接用慢病毒转染诱导T细胞的杀伤作用相比，简单方便、安全性高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1示出了抗原负载效率检测；图2示出了精准多肽筛选结果；图3示出了流式检测特异性细胞比例；图4示出了特异性细胞的TCR分布情况；图5示出了流式检测细胞上原有TCR的敲除情况；图6示出了抑制性靶点体外封闭情况；图7示出了本专利技术实施例所述RFFT2细胞对靶细胞的杀伤作用；图8示出了本专利技术实施例所述RFFT2细胞释放细胞因子的检测；图9示出了荷瘤小鼠生存曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式。在肿瘤细胞免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞已基本被证明无效。本专利技术提供一种新的T细胞，可用于细胞免疫治疗。本专利技术对T细胞进行改造，提供一种TCR-T细胞，杀伤力强、精准性高、覆盖多种瘤种。本专利技术实施例提供一种RFFT2细胞的构建方法，构建了一种用于细胞免疫治疗的TCR-T细胞(本文中命名为RFFT2细胞)。该构建方法可以包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)培养PBMC细胞，在培养过程中，用步骤S3所得精准多肽进行多次多肽冲击；S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；S6)以精准多肽作为抗原刺激所得RFF细胞，筛选能够识别所述精准多肽的特异性细胞；S7)通过测序得到所述特异性细胞的TCRβ链CDR3区序列，由所述TCRβ链CDR3区序列扩增得到TCR基因；S8)培养PBMC细胞，敲除细胞中原有的TCR基因，并转入步骤S7中所得能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，培养得到RFFT细胞；S9)用单抗药对步骤S8所得RFFT细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，培养得到RFFT2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD‑1、Tim‑3、LAG3、CTLA‑4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。

【技术特征摘要】
1.一种RFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)培养PBMC细胞，在培养过程中，用步骤S3所得精准多肽进行多次多肽冲击；S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；S6)以精准多肽作为抗原刺激所得RFF细胞，筛选能够识别所述精准多肽的特异性细胞；S7)通过测序得到所述特异性细胞的TCRβ链CDR3区序列，由所述TCRβ链CDR3区序列扩增得到TCR基因；S8)培养PBMC细胞，敲除细胞中原有的TCR基因，并转入步骤S7中所得能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，培养得到RFFT细胞；S9)用单抗药对步骤S8所得RFFT细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，培养得到RFFT2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。2.根据权利要求1所述的RFFT2细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养，得到FF细胞组合物包括：将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养5天；转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养至第10天；转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养至第14～21天。3.根据权利要求1所述的用于细胞免疫治疗的RFFT2胞，其特征在于，步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。4.根据权利要求3所述的RFFT2细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S4中，每...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，周子珊，解佳森，王海燕，李营营，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11