人源化GITR基因改造动物模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种GITR基因人源化动物模型的制备方法及应用。本发明专利技术还保护一种能够特异的靶向Gitr基因的sgRNA序列、一种多基因人源化动物模型的制备方法以及相关应用。本发明专利技术提供了一种适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，一种新的人源化动物模型制备方法，有利于相关疾病的研究，为生物医学实验的开展提供了有效的技术手段。本发明专利技术还涉及人源化基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化GITR基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Preparation and Application of Humanized GITR Genetically Modified Animal Model

The invention discloses a preparation method and application of a humanized animal model of GITR gene. The invention also protects a sgRNA sequence that can specifically target Gitr gene, a preparation method of a polygenic humanized animal model and related applications. The invention provides a tool mouse suitable for transplantation of human cells or tissues, a new method for preparing humanized animal model, which is beneficial to the study of related diseases, and provides an effective technical means for the development of biomedical experiments. The invention also relates to humanized genetically modified non-human animals, especially genetically modified rodents, but in particular to genetically modified mice, in particular to the construction method of humanized GITR gene animal model and its application in the field of biomedicine.

【技术实现步骤摘要】
人源化GITR基因改造动物模型的制备方法及应用
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化GITR基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是近年来肿瘤研究的一个重要领域。目前和肿瘤免疫治疗相关的一些药物已经用于治疗，已有药品上市并应用在多个适应症，如靶向T细胞共刺激分子CTLA-4、PD-1及其配体的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的平均应答率较低，临床实践已经证明，单一的免疫治疗策略治疗效果有限，在临床中一般需要结合两种或多种免疫治疗手段进行。开发更多可以用于提高免疫系统对肿瘤识别及杀伤能力的药物一直是免疫学研究的热点之一。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid-inducedtumornecrosisfactorreceptor，GITR)分子是一种I型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，包括胞外区、跨膜区域和胞浆区，在Treg细胞的高水平表达，也在CD4+和CD8+T细胞上低水平表达，经刺激活化后表达显著增加。GITR的配体GITRL，为肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，主要表达在抗原呈递细胞(APC)。GITR与GITRL结合后，传导T细胞表面的共刺激信号，和CD28、CD3一起辅助T细胞受体(TCR)的作用，刺激T细胞活化、增殖和分泌细胞因子(但其辅助刺激作用没有CD28强烈)；抑制Foxp3+Tregs免疫抑制活性；诱导激活巨噬细胞。已有研究证明GITR在多种免疫过程中起重要作用，在感染、肿瘤和自身免疫/炎性疾病治疗领域具有巨大应用价值。激动性GITR抗体可在小鼠体内诱发包括自身免疫性胃炎、卵巢炎、自身免疫性脑脊髓炎在内的多种自身免疫性疾病(TakahashiTetal.JExpMed.2000Jul17；192(2):303-10；ShimizuJetal.NatImmunol.2002Feb；3(2):135-42；JImmunolApril15,2004,172(8)4686-4690)，激动性GITR抗体也可在体外或体内抑制多种肿瘤的生长，且与其他免疫检查点抗体或肿瘤抗原联合使用可表现出比单一疗法更好的抗肿瘤效果(KoK.etal,JExpMed.2005Oct3；202(7):885-91；ClinCancerRes.2010May15；16(10):2781-91；CohenAD.etal,PLoSOne.2010；5(5):e10436；MiskaJetal,CancerImmunolImmunother.2016Dec；65(12):1555-1567；VillarrealDOetal,Oncotarget.2017Mar27.doi:10.18632/oncotarget.16605)；阻止GITR与GITRL结合能抑制淋巴细胞增殖，有利于改善某些自身免疫性疾病的进展，并能通过维持Treg的功能，降低移植排斥，从而提高移植成功率(MaJetal.AmJPathol.2016Jun；186(6):1559-67；SonawaneSBetal.Transplantation,2009,88(10):1169-1177)。此外，GITR还参与并增强抗病毒反应(AgostiniMetal.InfectImmun.2005Nov；73(11):7502-8)。鉴于GITR具备双靶向作用，既可直接激活T细胞，又可抑制Tregs细胞，因此被认为是较为理想的靶点。但目前对于GITR及其配体GITRL参与调控免疫系统的机制仍不太清楚，尚未有针对GITR靶点的药物上市，但已有多种用于治疗肿瘤的GITR激动型抗体(如TRX518、MEDI1873和MK-4166)处于Ⅰ期临床研究，初步结果都没有观察到严重毒副反应。可以预计，随着研究的不断深入，未来会有更多的机构和生物医药企业参与到针对GITR靶点的药物研发中来。(ToneMetal,ProcNatlAcadSciUSA.2003Dec9；100(25):15059–15064；KimYHetal,JImmunolNovember15,2015,195(10)4721-4729；SchaerDAetal,CurrOpinImmunol.2012Apr；24(2):217–224)。已知实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源基因已经实现，通过这种方式开发的基因人源化动物模型(humanizedanimalmodel)是动物模型未来的重要发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因序列替换动物基因组的同源基因序列，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升异种细胞或组织移植生长的效率，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达部分或全部人源蛋白，可作为识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(ScheerNetal,DrugDiscovToday.2013Dec；18(23-24):1200-11)。目前已有的与GITR基因相关的动物模型主要是Gitr基因敲除小鼠，主要应用于Gitr基因的生物学功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制的研究。最早是RonchettiS.等人(2002年)为了研究Gitr在T细胞发育中的作用，采用传统的染色体同源重组的方法将小鼠体内的Gitr基因用抗性基因片段替换，得到了Gitr-/-小鼠，发现该小鼠T细胞可正常发育，除Treg细胞百分比较低外，T细胞亚群与野生型相似无明显差异。使用抗体激活时，比野生型T细胞增殖更快、表达较高水平的白介素-2受体，并且对活化诱导的细胞死亡更敏感(Blood2002100:350-352)。进一步的研究确认了GITR在T细胞中的共刺激作用(EurJImmunol.2004Mar；34(3):613-22；JImmunol.2004Oct15；173(8):5008-20)。AgostiniM等人(2005)还利用该小鼠研究了GITR在念珠菌感染传播中的作用，发现相比野生型小鼠，Gitr-/-小鼠脾脏中存在较高比例的Th1极化T细胞，能更有效的清除念球菌，存活时间也更长。由于啮齿类如小鼠的Gitr蛋白与人GITR蛋白在氨基酸序列上同源性为60％左右，所以，一般情况下识别人GITR蛋白的抗体，无法识别小鼠Gitr，即在GITR靶点相关药物研发过程中，无法用普通小鼠来筛选和评价靶向人源GITR药物的药效。目前研究靶向药物药效广泛使用的是人源肿瘤异体移植小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括人GITR基因，该人源化动物模型体内可表达人或人源化GITR蛋白，同时内源GITR的蛋白表达降低或缺失。

【技术特征摘要】
2017.06.19 CN 201710465493X;2017.09.25 CN 201710871.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括人GITR基因，该人源化动物模型体内可表达人或人源化GITR蛋白，同时内源GITR的蛋白表达降低或缺失。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合GITR基因，所述嵌合GITR基因编码人源化GITR蛋白，所述人源化GITR蛋白的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述嵌合GITR基因编码胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述嵌合GITR基因编码的胞外区域包含人GITR蛋白胞外域的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人GITR基因部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Gitr启动子后；优选的，所述嵌合GITR基因的跨膜区为动物来源。3.根据权利要求2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，其中所述动物来源部分包括Gitr基因的4号外显子部分序列及其后所有外显子的全部序列；和/或所述人GITR基因部分为第1号外显子、2号外显子、3号外显子和/或第4号外显子的部分或全部序列。4.根据权利要求1-3任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行GITR人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行GITR人源化动物的构建。5.根据权利要求4所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，其中所述动物来源的Gitr基因为啮齿类动物来源的Gitr基因；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。6.根据权利要求5所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，将动物来源的Gitr的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和/或4号外显子的全部或部分序列替换为人GITR基因的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和/或4号外显子的全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQIDNO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQIDNO：8-14任一项所示；优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：11。7.根据权利要求1或2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化GITR蛋白为嵌合GITR蛋白，所述的嵌合GITR蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述胞外区域包含人GITR蛋白的全部或部分片段，所述跨膜区为动物来源；优选的，所述的嵌合GITR蛋白选自下列组中的一种：a)嵌合GITR蛋白序列为SEQIDNO：27所述氨基酸序列的部分或全部；b)嵌合GITR蛋白序列与SEQIDNO：27所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)编码嵌合GITR蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQIDNO：27所示蛋白的核苷酸序列杂交；d)嵌合GITR蛋白序列与SEQIDNO：27所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；e)嵌合GITR蛋白序列具有SEQIDNO：27所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。8.根据权利要求7所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合GITR基因，所述嵌合GITR基因编码权利要求7所述的嵌合GITR蛋白，或所述的嵌合GITR基因选自下列组中的一种：a)嵌合GITR基因为SEQIDNO：24所示的序列的部分或全部；b)嵌合GITR基因的CDS序列为SEQIDNO：25所示的序列的部分或全部；c)嵌合GITR基因的mRNA序列为SEQIDNO：26所示的序列的部分或全部；d)嵌合GITR基因序列与SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；e)嵌合GITR基因的序列在严格条件下，与SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的核苷酸序列杂交；f)嵌合GITR基因的序列与SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；g)嵌合GITR基因序列具有SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或h)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分为SEQIDNO：30所示的序列的部分或全部；i)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分为与SEQIDNO：30所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；j)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分在严格条件下，与SEQIDNO：30所示的核苷酸序列杂交；k)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分为与SEQIDNO：30所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；l)嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分为具有SEQIDNO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。9.一种权利要求1-8任一所述的方法构建的人源化动物模型或其后代，其特征在于，所述的人源化动物模型或其后代表达嵌合GITR蛋白。10.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸。11.根据权利要求10所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于Gitr基因的第1外显子至第4外显子。12.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述5’臂序列如SEQIDNO：28所示；所述3’臂序列如SEQIDNO：29所示。13.根据权利要求10-12任一项所述的靶向载体，其特征在于，其中替换的供体DNA序列片段来自人；优选的，替换的供体DNA序列为人GITR基因的核苷酸序列部分或全部；进一步优选的，所述人GITR基因的核苷酸序列包括人GITR基因DNA序列的第1外显子至第4外显子的全部或部分。14.根据权利要求13所述的靶向载体，其特征在于，所述人GITR基因的核苷酸序列选自NCBI登录号为NC_000001.11的第1204209-1206571位核苷酸；优选的，所述人GITR基因的核苷酸序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，郭雅南，白阳，姚佳维，黄蕤，赵磊，张美玲，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11