一种LRFFT2细胞的构建方法技术

本发明专利技术使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点进行抗原表位预测，连接并合成突变多肽表达基因序列；同时构建慢病毒载体，包装慢病毒，转染APC细胞，完成特异性LV细胞的改造，体外与从外周血中分离的PBMC共培养，筛选出有效多肽，通过精准有效多肽刺激的第二次冲击，将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的RFF细胞；再利用TCR－T技术原理进行了改造；改造后的T细胞在体外用抗体药物进行免疫抑制性信号的封闭，精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，得到更为攻防兼备的LRFFT2细胞。LRFFT2细胞可广泛应用于个体化精准治疗实体肿瘤。

Construction of LRFFT2 cells

The invention uses human peripheral blood for ctDNA sequencing or full exon sequencing of tumor tissue, screens mutation sites for antigen epitope prediction, links and synthesizes mutation polypeptide expression gene sequence, constructs lentivirus vector, packages lentivirus, transfects APC cells, completes transformation of specific LV cells, co-cultures in vitro with PBMC separated from peripheral blood, and screens out PBMC with lentivirus vector, packaging lentivirus and transfecting APC cells. Effective polypeptide, through the second shock of precise effective polypeptide stimulation, transforms ordinary T cells into RFF cells with more precise killing ability; then transforms them by TCR-T technology principle; the transformed T cells block the immunosuppressive signal with antibody drugs in vitro, precisely protects specific killing T cells from inhibition in vivo, and improves T cells'ability to kill tumors. Cell lethality, get more offensive and defensive LRFFT2 cells. LRFFT2 cells can be widely used in individualized and precise treatment of solid tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种LRFFT2细胞的构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种LRFFT2细胞的构建方法。
技术介绍
目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术，靶向递呈MAGEA3抗原。以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤免疫微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：1)使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点；2)根据突变位点进行抗原表位预测，合成突变多肽的基因序列；3)构建表达突变多肽的慢病毒载体，包装慢病毒；4)转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得LFF细胞；4)所述突变多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，筛选出有效的精准多肽；5)以所述精准多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，测序并得到特异性细胞的高频TCR基因；6)敲除外周血T细胞中原有的TCR基因，转入上步获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，获...

【技术特征摘要】
1.一种LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：1)使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点；2)根据突变位点进行抗原表位预测，合成突变多肽的基因序列；3)构建表达突变多肽的慢病毒载体，包装慢病毒；4)转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得LFF细胞；4)所述突变多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，筛选出有效的精准多肽；5)以所述精准多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，测序并得到特异性细胞的高频TCR基因；6)敲除外周血T细胞中原有的TCR基因，转入上步获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，获得TCR-T细胞；7)细胞表面免疫抑制性信号分子经抗体药物体外封闭，即得LRFFT2细胞。2.如权利要求1所述的LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述人源外周血...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，张天赋，周子珊，解佳森，吴子明，彭刚，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，焦顺昌，
类型：发明
国别省市：北京,11