本发明专利技术属于植物保护技术领域，公开了油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用，本发明专利技术提供了L.biglobosa的特异性检测靶标，该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种很好的区分，避免了假阳性的产生。针对该靶标设计的LAMP引物，可以检测到112 fg/μL的L.biglobosa基因组DNA，为油菜黑胫病菌的田间检测、口岸快速高通量检验检疫等提供了很好的工具。
【技术实现步骤摘要】
油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用
本专利技术属于植物保护
，具体涉及油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用。
技术介绍
油菜黑胫病(Blackleg)是一种世界性的油菜病害。据报道，在每个油菜生产季，造成的全世界经济损失高达9亿美元以上(Fernandoetal.,2016)，其病原菌是小球腔菌属真菌，可严重危害油菜等十字花科植物。小球腔菌属(Leptosphaeria)真菌包括两个近缘种：Leptosphaeriamaculans和L.biglobosa(ShoemakerandBrun.,2001)(Kaczmarek.,2009)。前者主要分布于加拿大、澳大利亚、欧洲等地，侵染部位在油菜茎基部，会造成茎基腐从而茎秆倒伏，对油菜生产危害严重，造成的损失大；后者全球均有分布，严重侵染十字花科作物，主要引起茎上部病斑，危害油菜生产(Fittetal.,2006b)。L.maculans具有极强的致病力，是造成世界各地油菜产量损失的重要原因，为我国禁止进境的植物检疫性病原菌(周国梁，2010)(周圆等，2016)。这两种病原菌在加拿大、澳大利亚、欧洲均有分布(Westetal.,2001)，而我国目前仅报道了Leptosphaeriabiglobosa，尚没有发现L.maculans。自2006年以来，随着我国油菜种植面积的减少，对进口油菜籽的需求量逐年攀升，极大增加了该病菌传入的几率(陈明爱等，2008)。目前，我国从欧洲、加拿大和澳大利亚等油菜主产区进口300多万t油菜籽，同时也从欧洲各国及日本、新西兰等国家进口十字花科蔬菜种子，这些地区均有油菜茎基溃疡病菌的分布记录(孙颖等，2015)。2010年湖北出入境检验检疫局在加拿大进境的油菜籽中首次检出油菜茎基溃疡病菌(L.maculans)(王振华等，2010)。油菜黑胫病菌的检测方法只有形态学观察法、聚合酶链式反应(PCR)检测方法和发病症状观察法。但由于，现存的检测方法周期长、对仪器设备以及工作人员要求高、准确性低等劣势，难以满足口岸的高通量快速检测要求。因此，一种快速、准确、灵敏简便的检测技术对于口岸检测油菜黑胫病菌显得尤为重要。目前对于油菜黑胫病菌的分子检测仅有PCR方法(Liuetal.,2006)，Liu根据L.biglobosa和L.maculans的ITS序列(利用引物ITS4和ITS5扩增L.maculans菌株UK7以及L.biglobosa菌株UK5,UK21和UK28获得)，利用L.biglobosa和L.maculansITS上一段相同的碱基序列设计一条共同反向引物，另外分别设计两条共向引物，结果根据扩增得到的片段大小，将两菌区分，但其特异性不足，在进行实际PCR扩增操作时，常会将其他物种的全基因组DNA也扩增出与L.biglobosa同样大小的基因片段。因此，在L.biglobosa的分子检测上仍需要进行完善。核酸扩增技术是一种重要的分子检测手段，环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新型的快速核酸扩增方法(Notomietal.,2000)，该方法针对靶基因序列的6个不同区域设计4种特异性LAMP引物，利用一种链置换活性的BstDNA聚合酶在等温条件(65℃左右)孵育30-60min，即可完成核酸扩增反应，可使目的DNA在短时间内从数份扩增至109份(Nagamineetal.,2002)，还可以通过设计两条环引物使反应速度提升。LAMP扩增过程中会产生大量的焦磷酸根离子，会与体系中镁离子结合形成白色的焦磷酸酶沉淀(Morietal.,2001)，从而可以肉眼直接观察，同时可以在反应结束的体系中加入SYBRGreenI核酸染料，阳性反应会变成荧光绿色，而阴性则保持橙色不变(Tomotadaetal.,2003)。LAMP技术具有灵敏度高、特异性强、简便快捷、检测周期短和仪器设备要求低等优点，目前已经被广泛应用于临床、食品安全、农业等的检测领域，植物上主要应用于植物病毒、细菌、真菌病害及转基因等的检验检疫工作，该技术具有很高的应用价值。LAMP为特异性检测油菜黑胫病菌提供了新的思路，但LAMP引物设计对靶基因的GC含量要求很高，并非所有的序列都适合设计LAMP引物，同时，在实际操作过程中也发现，并非设计出的6条LAMP引物就适合进行扩增。有时候环引物的加入反而会使扩增的特异性变差。因此，最终的LAMP扩增效果取决于目的片段的选取以及LAMP引物的有效设计。针对上述问题，本专利技术筛选出了油菜黑胫病菌(L.biglobosa)特异性序列，该序列在油菜黑胫病菌中特异性存在，能对近缘种进行很好的区分；同时针对该序列，设计了油菜黑胫病菌(L.biglobosa)的特异性LAMP检测引物，该引物具备良好的特异性和灵敏性，具有极大的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了油菜黑胫病菌特异性序列在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌特异性序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术的另一个目的在于提供了针对油菜黑胫病菌特异性序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌特异性序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术还有一个目的在于提供了针对菜黑胫病菌特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为F3:TAGGTGAACCTGCGGAAG、B3:GTTACTGACGCTGACTGC、FIP:GGAAAGGGACAGAAATTAAGCCAAAATTACCCTTCTATCAGGGGAT、BIP:TCTGATTCTACCCATGTTTTTTGCGAATTACAAGTGGTTTGAATTGTC、LB:GTGGGCTTGCCTGCCAAAA。为了达到以上目的，本专利技术采取以下技术措施：油菜黑胫病菌特异性序列在制备油菜黑胫病菌(L.biglobosa)检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌特异性序列为SEQIDNO.1所示，只要该序列应用于L.biglobosa的检测，都属于本专利技术的保护内容。针对油菜黑胫病菌特异性序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌特异性序列为SEQIDNO.1所示。只要针对该序列设计的引物用于油菜黑胫病菌的检测，都属于本专利技术的保护内容。以上所述的应用中，优选的，针对该特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为：F3:TAGGTGAACCTGCGGAAG、B3:GTTACTGACGCTGACTGC、FIP:GGAAAGGGACAGAAATTAAGCCAAAATTACCCTTCTATCAGGGGAT、BIP:TCTGATTCTACCCATGTTTTTTGCGAATTACAAGTGGTTTGAATTGTC、LB:GTGGGCTTGCCTGCCAAAA。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术提供了L.biglobosa的特异性检测靶标，在申请日之前，还从未有此相关报道。该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种能很好的区分，避免了假阳性的产生。2.针对L.biglobosa的特异性序列设计了LAMP引物，与其他常规的6条LAMP引物不同本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.SEQ ID NO.1所示多核苷酸在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌为L. biglobosa。
【技术特征摘要】
1.SEQIDNO.1所示多核苷酸在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌为L.biglobosa。2.针对SEQIDNO.1所示多核苷酸设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，所述的引物为：F3:TAGGTGAACCTGCGGAAG、B3:...
【专利技术属性】
技术研发人员：李国庆，杜然，杨龙，张静，吴明德，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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