一种球形核酸探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种球形核酸探针及其制备方法和应用，该球形核酸探针由纳米金作为球形核酸的核心，由三链杂交形成的双链的DNA与适配体装到纳米金的表面作为球形核酸探针的外壳。本发明专利技术的载药球形核酸探针不仅能够检测端粒酶的活性而且探针表面的DNA复合物中富含CG核苷酸可以携带抗癌药物阿霉素，因此该探针对癌细胞进行治疗，并且探针表面修饰的适配体使该探针能在复杂的生物环境中具有靶向性。本发明专利技术的载药球形核酸探针具备良好的稳定性，同时，该探针具备良好生物相容性且对细胞无毒副作用，具备检测范围宽，灵敏度高等优点，同时，该探针检测速度快，并且制备步骤简单。

A spherical nucleic acid probe and its preparation and Application

The invention discloses a spherical nucleic acid probe and its preparation method and application. The spherical nucleic acid probe consists of nanogold as the core of the spherical nucleic acid, and double-stranded DNA and adapter formed by three-stranded hybridization are mounted on the surface of nanogold as the shell of the spherical nucleic acid probe. The drug-loaded spherical nucleic acid probe can not only detect the activity of telomere, but also contain CG-rich nucleotides on the DNA complex of the probe surface, which can carry the anti-cancer drug doxorubicin. Therefore, the probe can treat cancer cells, and the adapter modified by the probe surface enables the probe to be targeted in complex biological environment. The drug-loaded spherical nucleic acid probe has good stability, good biocompatibility, no toxic side effects on cells, wide detection range and high sensitivity. At the same time, the probe has fast detection speed and simple preparation steps.

【技术实现步骤摘要】
一种球形核酸探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及端粒酶活性检测领域以及载药领域，具体涉及一种载药球形核酸探针及其制备方法和应用。
技术介绍
端粒酶是一种特殊的核蛋白逆转录酶。格雷德和布莱克本在1985年第一次发现端粒酶。端粒酶全酶是由一段RNA模板(hTR)、端粒酶催化亚基(hTERT)、角化不良蛋白、端粒酶Cajal体蛋白1(TCAB1)和人逆转录蛋白酶组成。端粒酶在模板RNA作用下能够在染色体末端上合成端粒DNA重复序列(TTAGGG)n。端粒酶模板RNA是由451个核苷酸组成，其模板序列是3’-CAAUCCCAAUC-5’。因为，端粒酶可以防止端粒在细胞分裂时候变短，所以端粒酶对癌细胞的无限增殖起着至关重要的作用。在正常的细胞中端粒酶活性受到抑制而未对端粒产生保护作用。在85％-90％的肿瘤细胞中端粒酶的活性没有受到抑制，从而造成细胞的无限增殖并不会凋亡。因此，在正常体细胞与肿瘤细胞之间不同的端粒酶活性表达程度可以作为肿瘤标志物以及潜在的化疗靶点。在1997年，Kim发表了端粒重复序列放大的方案(TARP)。简而言之，一个合成的非端粒重复DNA序列作为引物。然后，引物在生物样品的端粒酶的作用下不断地延伸。最后用PCR放大延伸的产物。但是，TRAP方法有很多的缺点。首先该方法浪费时间，然后不容易定量PCR产物以及不纯净的端粒酶裂解液会影响TARP方法。虽然，当今人们研究了很多种方法去避开TRAP法的特性，但是，这些方法变得更加复杂繁琐以及灵敏度低等缺点。因此，一种快速简单灵敏度高的方法是端粒酶检测中急需解决的问题。荧光法则可以避免以上的缺点，检测端粒酶活性不仅灵敏度高而且简单。但是荧光分子大部分都有毒不适合细胞内检测。因此，我们使用球形核酸探针进行检测端粒酶。1996年，ChadA.Mirkin介绍一种将DNA修饰在纳米材料的合成方法。因此，通过这种合成方法使得纳米材料表面修饰上一层DNA的外壳从而形成球形核酸结构。因此，球形核酸是由一个纳米材料的内核和一层DNA外壳组成。球形核酸结构不仅拥有纳米材料和DNA的性质而且还拥有不同与纳米材料和DNA特别的性质。例如，降低了细胞或者身体对于纳米材料的免疫反应；提高了双链DNA的融化温度；提高细胞对于纳米材料以及DNA摄入能力；并且也提高DNA的稳定性。目前，球形核酸仅仅适用于检测。其缺乏多功能性而且在复杂细胞体内缺少靶向性。
技术实现思路
专利技术的目：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种球形核酸探针，该探针可以用于检测端粒酶活性以及癌细胞治疗，该球形核酸结构能够快速的灵敏的检测端粒酶活性，同时，也可以作为载药平台进行癌细胞治疗。本专利技术还提供球形核酸探针的其制备方法和应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种新型载药球形核酸探针，由纳米金作为球形核酸的核心，三链杂交的双链DNA组与适配体装到纳米金的表面作为球形核酸探针的外壳。其中，所述球形核酸探针是一种壳核结构，纳米金作为核，而双链DNA复合物与适配体形成壳。其中，所述形成三链杂交形成的双链DNA复合物的三种特定的DNA序列：F、Q、TSP与适配体的序列A分别由SEQIDNO.1-4所示。作为优选，所述纳米金是通过柠檬酸钠还原氯金酸合成得到。纳米金的直径为13nm。本专利技术所述的载药球形核酸探针的制备方法，包括如下步骤：(1)制备纳米金作为球形核酸的核心，同时将三种特定的单链DNA序列杂交成一种三链DNA复合物；(2)将三链杂交形成的双链的DNA复合物与适配体利用盐老化法组装到纳米金的表面，然后通过离心重悬得到纯净的球形核酸探针；其中，步骤(1)所述三种单链DNA按摩尔比率为1：1：1杂交形成双链DNA复合物。作为优选，步骤(2)所述三链杂交形成的双链的DNA与适配体连接前与纳米金的体积比例为120：12：1000。本专利技术所述的球形核酸探针在制备检测端粒酶活性试剂盒中的应用。本专利技术所述的球形核酸探针在负载抗肿瘤药物中的应用。进一步地，所述球形核酸探针与抗肿瘤药物作用，然后离心分离获得纯净的载药球形核酸探针。所述抗肿瘤药物可以为阿霉素，在球形核酸探针的纳米金的表面DNA携带有阿霉素。本专利技术中使用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶，然后，将端粒酶提取液与步骤(2)得到的球形核酸探针作用，最后使用荧光光度计进行检测；当样品中存在端粒酶时，端粒酶会在端粒酶引物3端上合成并延伸出端粒重复序列TTAGGG。延伸后的端粒酶引物通过链取代反应取代杂交在DNA复合物上的F链。因此，标记有荧光素的F链产生荧光，于是可以用荧光分光光度计进行检测并进行定量分析。本专利技术步骤(2)得到纯净的球形核酸探针与阿霉素作用一段时间，然后离心分离获得纯净的载药的球形核酸探针；然后让探针与癌细胞作用一段时间即可杀死癌细胞。本专利技术中球形核酸探针不仅能够检测端粒酶的活性而且探针表面的DNA复合物中富含CG核苷酸可以携带抗癌药物阿霉素，因此该探针对癌细胞进行治疗，并且探针表面修饰的适配体使该探针能在复杂的生物环境中具有靶向性。适配体是一段DNA序列或者RNA序列甚至是一段肽链，但其具有一定结合目标分子的能力。本专利技术提出一种新型的球形核酸探针用于检测端粒酶活性以及癌细胞治疗的机理流程如图1所示，如图1在纳米金球表面修饰两种DNA，一种双链DNA能给检测端粒酶活性，另一种DNA为适配体能够靶向癌细胞。当端粒酶存在时，双链DNA就会产生游离的单链荧光探针从而产生荧光信号。同时，这两种DNA富含多CG结构从而可以嵌入抗癌药物阿霉素治疗癌细胞。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1、本专利技术中新型载药球形核酸探针具备良好的稳定性，能在复杂的生物环境中存在而且无假阳性信号产生，只在端粒酶作用下产生信号。同时，该探针具备良好生物相容性且对细胞无毒副作用。2、本专利技术新型载药球形核酸探针具备检测范围宽，灵敏度高等优点，同时，该探针检测速度快，制备步骤简单。3、本探针表面的DNA可以携带抗癌药物，可以对癌细胞进行靶向治疗。该探针实现多功能化。附图说明图1为本专利技术提出一种新型的球形核酸探针用于检测端粒酶活性以及癌细胞治疗的示意图；图2为本专利技术的纳米金的透射电镜图(TEM)；图3为本专利技术的荧光光谱图；图4为本专利技术不同浓度肿瘤细胞的端粒酶提取液对应的荧光光谱图；图5为本专利技术球形核酸探针与细胞作用激光共聚焦照片；图6为本专利技术载药后球形核酸探针与细胞作用激光共聚焦照片；图7为本专利技术载药后球形核酸探针MTT图；图8为球形核酸探针的检测线性图。图9为球形核酸探针与不同细胞作用后的流式荧光图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1以人子宫颈癌细胞作为检测对象与治疗对象，然后，利用该球形核酸探针进行检测端粒酶活性并进行癌细胞治疗。步骤一、制备纳米金13nm的金纳米(AuNP)核心合成是根据柠檬酸钠还原氯金酸的方法进行操作。首先，将实验中所用到的玻璃仪器进行浸泡12h王水，并用大量蒸馏水进行洗净烘干。然后，配置100mL的质量分数0.01％的氯金酸溶液，并将其转移到250mL的三颈烧瓶中120℃加热至沸腾。然后，在不断地搅拌下快速加入3.5mL的质量分数1％柠檬酸钠溶液。同时，保持沸腾状态15min并不断搅拌。反应结束后，将反应的溶液放在室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种球形核酸探针，其特征在于，由纳米金作为球形核酸的核心，由三链杂交形成的双链的DNA与适配体装到纳米金的表面作为球形核酸探针的外壳。

【技术特征摘要】
1.一种球形核酸探针，其特征在于，由纳米金作为球形核酸的核心，由三链杂交形成的双链的DNA与适配体装到纳米金的表面作为球形核酸探针的外壳。2.根据权利要求1所述的球形核酸探针，其特征在于，所述载药球形核酸探针是一种壳核结构，纳米金作为核，而三链杂交形成的双链的DNA与适配体形成壳。3.根据权利要求2所述的球形核酸探针，其特征在于，所述形成三链杂交形成的双链的DNA的三种特定的DNA与适配体的序列分别由SEQIDNO.1-4所示。4.根据权利要求1-3所述的球形核酸探针，其特征在于，所述纳米金是通过柠檬酸钠还原氯金酸合成得到。5.一种权利要求1所述的球形核酸探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备纳米金作为球形核酸的核心，同时将三种特定的单链DNA序列杂交成一种双链DNA；(2)将三链杂交...

【专利技术属性】
技术研发人员：张卉，杨国庆，乔斌，郭群群，姜居倩，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32