一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点基因型的方法技术

本发明专利技术公开了一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，该方法通过NCBI数据库检索潜在基因插入缺失位点信息，截取插入缺失片段上下游区域进行设计特异性引物，DNA混池PCR扩增测序，确认真实的插入缺失位点，对真实存在的插入缺失位点进行无其它多态位点确认，利用高分辨率溶解曲线对动物大群体进行个体基因型鉴定，再通过抽样对其鉴定结果进行PAGE验证和测序验证。明显提高了基因插入缺失的检测准确度，基因型鉴定效率约提高3‑5倍。通过PCR与聚丙烯酰胺凝胶电泳方法证明该方法所进行的分型可靠有效。为分子标记检测工作提供更为丰富的鉴定手段，为家畜育种工作提供新的可靠的评价方法。

A Method for Identification of Animal Gene Insertion Deletion Site Genotypes by HRM

The invention discloses a method for identifying insertion deletion sites of animal genes by HRM. The method retrieves information of potential insertion deletion sites through NCBI database, intercepts upstream and downstream regions of insertion deletion fragments, designs specific primers, amplifies and sequences DNA pool PCR, confirms real insertion deletion sites, and realizes the existence of insertion deletion sites. No other polymorphic loci were identified by inserting deletion loci. Individual genotypes of large animal populations were identified by high resolution dissolution curve. The identification results were verified by PAGE and sequencing through sampling. The accuracy of gene insertion deletion detection was significantly improved, and the efficiency of genotype identification was increased by 3 5 times. The typing by PCR and polyacrylamide gel electrophoresis proved that the method was reliable and effective. It provides more abundant identification means for molecular marker detection and new reliable evaluation methods for livestock breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点基因型的方法
本专利技术属于分子生物学、细胞工程
，具体涉及一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点基因型的方法。
技术介绍
生命的遗传信息存贮于DNA序列之中，高等生物每一个细胞的全部DNA构成了该生物的基因组。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础，是生物多样性的最初变异来源。基因组中大量存在插入缺失位点，相较单核苷酸多态性的检测与应用，插入缺失引起更容易被检测到且检测准确性较高被视为一种新的分子选育标记，具有较为明显的应用价值备受关注。目前基因插入缺失的检测方法存在一定的局限性，多采用直接测序法和DNA片段长度多态性检测法，前者费用高昂，而后者实验操作难度大，鉴定花费时间长，结果存在一定程度的假阳性概率，不利于大批量对基因插入缺失位点的鉴定工作。因此，有必要研发一种新型基因插入缺失的鉴定方法，快速准确对基因插入缺失位点进行鉴定，从而降低成本，体高鉴别效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点基因型的方法，该方法可以在绵羊PLAGL1基因插入缺失位点中的应用。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，该方法通过NCBI数据库检索潜在基因插入缺失位点信息，截取插入缺失片段上下游区域进行设计特异性引物，DNA混池PCR扩增测序，确认真实的插入缺失位点，对真实存在的插入缺失位点进行确认无其它多态位点，利用高分辨率溶解曲线对动物大群体进行个体基因型鉴定，再通过抽样对其鉴定结果进行PAGE验证和测序验证。根据本专利技术，所述的无其它多态位点包括SNP和插入缺失。进一步的，所述的特异性引物为：PLAGL1-P1：F：TAAACTATCTTCAAAGGGCTTA；R：TCAACTCCCCATTATCTGTG；PLAGL1-P2：R：CGGCCTCCACTCCAGAGGTAT；F：TAAAATGTTCACAGTACTATCTG；PLAGL1-P3：F：TAAAATGTTCACAGTACTATCTG；R：CACAAAATGAAGAAACCTG；PLAGL1-P5：F：AATACACCTCTGTCTTGGTCATC；R：TTGGGTAGGGATTGGACTTT；PLAGL1-P7：F：TTCTTTGTCCCTTCTTTATCCC；R：TTTGAGTTTACAGCCTTTGCTC；PLAGL1-P8：F：ACAGGACGCTCCCACGAC；R：CATACAAGTATAGGAACTGGCTCA；PLAGL1-P9：F：CACCACCACTTCACCATGCTAC；R：TCCCTCCTTGTCTGAGATTTCCTT；PLAGL1-P10：F：CCACCAATCTGTTCCAGG；R：AGACAAACCCAAACTGATGAA；PLAGL1-P11：F：AAACCCACCTGCCACCTA；R：CATTTGGATTTCCCCGTAA；PLAGL1-P12：F：AAATACGGTCCCGTCACTTGG；R：GAATGTATAGAATGGATACGTGCAGAA；PLAGL1-P13：F：TTCCACAGGATGCTACAA；R：TCCAGTAATATTCTTAAATTCC；PLAGL1-P14：F：CCCCGACATTCCATAAATAAACTGC；R：CGCCCTCCTGTCATCAGCAAC。本专利技术的HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，能够显著提升基因插入缺失位点的基因型分辨通量和显著降低基因插入缺失位点的分型时间，为分子标记检测工作提供更为丰富的鉴定手段，为育种工作提供新的可靠的评价方法，从而达到快速、准确鉴别基因插入缺失位点的目的。与现有技术相比，具有以下优点：(1)通过HRM(高分辨率溶解曲线，HighResolutionMelting)对动物基因插入缺失位点进行分析鉴定，准确度高，分型通过荧光定量PCR仪进行，避免人为因素对基因型判定的干扰。(2)通过HRM对动物基因插入缺失位点进行分析鉴定，速度快，分型整个时间约为1小时30分钟，较原有直接测序和电泳DNA片段长度多态性分析方式花费时间减少约一半。(3)通过HRM对动物基因插入缺失位点进行分析鉴定，通量大，每次分型可进行96个样品的同时操作，若换用384孔板，则通量仍将扩大4倍，较原有电泳分型通量提升约2-8倍。(4)通过HRM对动物基因插入缺失位点进行分析鉴定，每个样品分型鉴定过程的费用不超过1元，应用成本低廉。附图说明图1是采用高分辨率溶解曲线基因型鉴定图；图2是高分辨率溶解峰基因型鉴定图；图3是不同基因型测序图与聚丙烯酰胺凝胶电泳图；以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。具体实施方式申请人通过前期研究发现，现有基因插入缺失检测方法中存在检测通量小，费用高等缺陷，鉴于基因插入缺失位点在分子育种中的重要价值，申请人通过比较现有凝胶电泳手段和直接测序等手段，希望通过高分辨率溶解曲线分析动物基因插入缺失位点基因型。本实施例给出一种新型的HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，该方法通过NCBI数据库检索潜在基因插入缺失位点信息，截取插入缺失片段上下游区域进行特异性引物设计，DNA混池PCR扩增测序，确认真实的插入缺失位点，对真实存在的插入缺失位点进行无其它多态位点确认(无其它多态位点包括SNP和插入缺失)，利用高分辨率溶解曲线对动物大群体进行个体基因型鉴定，再通过抽样对其鉴定结果进行PAGE验证和测序验证。特异性引物设计要求尽量短，保证变异位点和野生位点之间存在较大的退火温度差异。申请人经过严格的引物鉴定工作之后，通过荧光定量PCR采用饱和荧光染料扩增目的片段，在进行溶解曲线分析过程中尽量降低升温速率和提高荧光信号的采集频率，保证高分辨率溶解曲线分析过程中的准确性，对分析出的结果进行聚丙烯酰胺凝胶电泳基因型验证和测序验证，确保分型正确，对分型结果进行统计，分析其品种间基因型分布差异和品种间基因频率分布差异，对基因插入缺失位点不同基因型与生长发育相关性状进行关联分析，并对其育种价值进行相应的评估。以下是专利技术人给出的具体操作过程。以下实施例涉及的试剂、DNA样本来源如下：本实施例的动物大群体品种选择绵羊，绵羊的DNA样本采集自新疆、兰州、陕西和浙江等4个省份，样本采集信息见表1。表1：绵羊品种样本信息DNA提取试剂盒购自艾德莱生物科技有限公司；RT-PCR试剂盒天根生物科技有限公司；相关引物购自上海生工生物科技有限公司。实施例1：7个绵羊品种PLAGL1基因HRM鉴定插入缺失位点绵羊血液样品和耳组织样本采集：小尾寒羊样本262个，采集自甘肃省兰州市，同羊样本166个，采集自陕西省白水县，兰州大尾羊样本67个，采集自甘肃省兰州市，湖羊样本200个，采集自浙江省湖州市，多浪羊样本96个，采集自新疆石河子市，巴什拜羊样本93个，采集自新疆石河子市，阿勒泰羊样本92个，采集自新疆阿勒泰市，绵羊样本共计976个，全部样本通过干冰运输处理并保存至-80℃冰箱中。绵羊样本DNA提取工作：采用艾德莱生物科技有限公司全血DNA提取试剂盒操作步骤：取新鲜血液200微升放入1.5mL离心管中，加入蛋白酶K溶液(20mg/mL)20微升，充分混匀，在加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，其特征在于，该方法通过NCBI数据库检索潜在基因插入缺失位点信息，截取插入缺失片段上下游区域进行设计特异性引物，DNA混池PCR扩增测序，确认真实的插入缺失位点，对真实存在的插入缺失位点进行无其它多态位点确认，利用高分辨率溶解曲线对动物大群体进行个体基因型鉴定，再通过抽样对其鉴定结果进行PAGE验证和测序验证。

【技术特征摘要】
1.一种HRM鉴定动物基因插入缺失位点的方法，其特征在于，该方法通过NCBI数据库检索潜在基因插入缺失位点信息，截取插入缺失片段上下游区域进行设计特异性引物，DNA混池PCR扩增测序，确认真实的插入缺失位点，对真实存在的插入缺失位点进行无其它多态位点确认，利用高分辨率溶解曲线对动物大群体进行个体基因型鉴定，再通过抽样对其鉴定结果进行PAGE验证和测序验证。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的无其它多态位点包括SNP和插入缺失。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的特异性引物为：PLAGL1-P1：F：TAAACTATCTTCAAAGGGCTTA；R：TCAACTCCCCATTATCTGTG；PLAGL1-P2：F：GCCTGTCCCGGCTTTCAGA；R：CGGCCTCCACTCCAGAGGTAT；PLAGL1-P3：F：TAAAATGTTCACAGTACTATCTG；R：CACAAAATGAAGAAACCTG；PLAGL1-P5：F：AATACACCTCTGTCTTGGTCATC；R：TTGGGTAGGGATTGGACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑辉，孙秀柱，赵海东，邬明丽，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61