一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其包括以下步骤：S1、环介导等温扩增技术(LAMP)引物的设计与合成；S2、DNA模板的制备：制备志贺氏菌菌液，人工污染脱脂奶粉样品，采用热裂解法提取细菌基因组；S3、样品的LAMP检测：取DNA模板分别加入内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB在LAMP反应体系及反应条件下进行扩增，最后分别取扩增产物通过直接目测法或琼脂糖凝胶电泳法，判断结果。对于本发明专利技术，不仅操作简单、检测速度快，而且灵敏度高、特异性强、准确度高，检出限达到1.0×10

Detection of Shigella in Milk Powder by Ring Mediated Isothermal Amplification

The invention discloses a method for detecting Shigella in milk powder by loop-mediated isothermal amplification technology, which includes the following steps: design and synthesis of S1, loop-mediated isothermal amplification technology (LAMP) primers; preparation of S2 and DNA templates: preparation of Shigella liquid, artificially contaminated defatted milk powder samples, and extraction of bacterial base by pyrolysis method. For group S3 and sample LAMP test: DNA template was added with internal primer FIP/BIP, outer primer F3/B3 and ring primer LF/LB to amplify under LAMP reaction system and reaction conditions. Finally, the amplification products were judged by direct visual test or agarose gel electrophoresis. For the invention, not only the operation is simple, the detection speed is fast, but also the sensitivity is high, the specificity is strong, and the accuracy is high, and the detection limit reaches 1.0*10.

【技术实现步骤摘要】
一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法。
技术介绍
志贺氏菌为兼性厌氧型革兰氏阴性菌，可通过消化道传播并引发机体急性感染性痢疾，因此也被称作为痢疾杆菌。志贺氏菌附着力、侵袭力强，其进入机体后能分泌大量的内、外毒素，造成腹痛、腹泻、局部粘膜炎症甚至溃疡、坏死等病症，尤其对婴幼儿具有致命性危害。流行病显示，感染性痢疾多发于6-9月，主要为患病者进食被志贺氏菌污染的食物所致，具有感染率高、致病率高等特点。志贺氏菌通过食品感染人类，在奶制品、水产品、鸡肉、水果、面包等食品中经常被检出。发病时若不及时救助，会危及生命。因此，志贺氏菌是食品安全领域的重点监测对象，建立并应用快速、准确的志贺氏菌检测方法具有重要意义。目前，对志贺氏菌的检测方法主要有传统的分离鉴定方法、免疫学方法及分子生物学方法。然而，传统的志贺氏菌检测方法是根据国家标准(GB4789.4-2016)进行的，其步骤比较繁琐，耗时较长，至少需要4-7天才能得出明确的诊断结果，虽然此方法为“金标准”，但已不能满足实际工作的需要；免疫学方法主要利用抗原-抗体之间的特异性反应，是一种定性或定量的诊断技术，其灵敏性和特异性比较高，但其操作复杂、试验条件要求高等因素，在临床应用上带来了较大的不便；分子生物学方面需要昂贵的仪器设备，且受人为操作技术的影响较大，不能区别核酸来源于死细胞还是活细胞，在基层单位也很难普及和推广应用。
技术实现思路
为了克服上述技术缺陷，本专利技术的目的是提供一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其不仅操作简单、检测速度快，而且灵敏度高、特异性强、准确度高。为了解决上述问题，本专利技术按以下技术方案予以实现的：一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，包括以下步骤：S1、环介导等温扩增技术(LAMP)引物的设计与合成：根据志贺氏菌ipaH基因(GenBank登录号：HE616529.1)，并用生物学在线软件分析该基因的保守核苷酸序列，针对ipaH基因的保守区域，结合环介导等温扩增方法的引物设计原则，利用PrimerExplorerV4在线引物设计软件筛选并合成LAMP引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB；S2、DNA模板的制备：制备志贺氏菌菌液，人工污染脱脂奶粉样品，将污染样品梯度稀释，采用热裂解法提取细菌基因组，得到不同浓度的DNA模板溶液；S3、样品的LAMP检测：取步骤S2所得不同浓度的DNA模板分别加入步骤S1所得内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB在LAMP反应体系及反应条件下进行扩增，分别取扩增产物通过直接目测法或琼脂糖凝胶电泳法，判断结果。进一步的，步骤S1所得LAMP引物包括：内引物FIP为TCCGCGACACGTTCCCTCTATTGTCAGTACGCTTCGCC，内引物BIP为TGCCGATTTGAAGGCCGGTACACCGTGGTCCGTTCTGAA，外引物F3为ACTCTCCCAGTGTGCTTTGAT，外引物B3为CTTTTCGTGAAAAATTGAAA，环引物LF为TGGCATGCTTTGAACAGATAA，环引物LB为TATTGAGTTCGTTCTAATCAACT。进一步的，步骤S2包括：将志贺氏菌接种于R&F志贺氏菌属显色培养基，37℃培养16-24h，再挑取单菌落于LB培养液中，37℃、200r/min条件下，振荡培养16-48h，得到所述志贺氏菌菌液。进一步的，步骤S2包括：将所得志贺氏菌菌液接种到脱脂奶粉样品中，10倍梯度稀释所述污染样品，使所述污染样品中志贺氏菌的浓度依次为100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL，再分别取1.0mL所述污染样品，10000-12000r/min离心2-5min，灭菌蒸馏水洗涤两次，再用300μLTE缓冲液悬浮，隔水煮沸10-20min，8000-10000r/min离心10-20min，取上清液，得到不同浓度的所述DNA模板溶液。进一步的，步骤S3包括：所述LAMP反应体系(25μL)为：2.5μL10×ThermoPol缓冲液，1.5μLMgSO4，3μL引物，3.5μLdNTPs，2.5μL甜菜碱，1μLBst2.0DNA聚合酶，2μLDNA模板，1μL钙黄绿素，8μLddH2O。进一步的，3μL所述引物包括1μL的20μmol/L内引物FIP/BIP、1μL的10μmol/L外引物F3/B3、1μL的15μmol/L环引物LF/LB。进一步的，步骤S3包括：所述LAMP反应条件为：将配备好的所述LAMP反应体系于60-65℃恒温水浴扩增30-60min，再75-85℃使所述Bst2.0DNA聚合酶失活。进一步的，步骤S3包括：所述LAMP反应条件为：将配备好的所述LAMP反应体系于63℃恒温水浴扩增60min，再80℃使所述Bst2.0DNA聚合酶失活。进一步的，步骤S3包括：直接观察反应混合液中是否显示绿色，显示绿色，则为阳性结果，未显示绿色，则为阴性结果。进一步的，步骤S3包括：分别取5μL的所述扩增产物，在30g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于凝胶成像系统照相，出现梯度条带，则为阳性结果，未出现梯度条带，则为阴性结果。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术提供的一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，克服了目前传统的分离鉴定方法步骤比较繁琐、耗时较长，免疫学方法操作复杂、试验条件要求高，以及分子生物学方法需要昂贵的仪器设备、受人为操作技术的影响较大等缺点；本专利技术的LAMP检测方法检测奶粉中的志贺氏菌，不仅操作简单、检测速度快，而且灵敏度高、特异性强、准确度高。(2)本专利技术所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，检出限达到1.0×101CFU/mL，检测准确度为99.09％。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：图1为本专利技术所述环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的流程图；图2为实施例1-6的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，1为阴性对照，2-7依次为实施例1-6的电泳结果；图3为实施例1稀释倍数为100-108倍的琼脂糖凝胶电泳结果；图4为对比例1稀释倍数为100-108倍的琼脂糖凝胶电泳结果。具体实施方式各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，如图1所示，包括以下步骤：S1、环介导等温扩增技术(LAMP)引物的设计与合成：根据志贺氏菌ipaH基因(GenBank登录号：HE616529.1)，并用生物学在线软件分析该基因的保守核苷酸序列，针对ipaH基因的保守区域，结合环介导等温扩增方法的引物设计原则，利用PrimerExplorerV4在线引物设计软件筛选并合成LAMP引物：内引物FIP：TCCGCGACACGTTCCCTCTATTGTCAGTACGCTTCGCC；内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、环介导等温扩增技术(LAMP)引物的设计与合成：根据志贺氏菌ipaH基因(GenBank登录号：HE616529.1)，并用生物学在线软件分析该基因的保守核苷酸序列，针对ipaH基因的保守区域，结合环介导等温扩增方法的引物设计原则，利用Primer Explorer V4在线引物设计软件筛选并合成LAMP引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB；S2、DNA模板的制备：制备志贺氏菌菌液，人工污染脱脂奶粉样品，将污染样品梯度稀释，采用热裂解法提取细菌基因组，得到不同浓度的DNA模板溶液；S3、样品的LAMP检测：取步骤S2所得不同浓度的DNA模板分别加入步骤S1所得内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB在LAMP反应体系及反应条件下进行扩增，分别取扩增产物通过直接目测法或琼脂糖凝胶电泳法，判断结果。

【技术特征摘要】
1.一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、环介导等温扩增技术(LAMP)引物的设计与合成：根据志贺氏菌ipaH基因(GenBank登录号：HE616529.1)，并用生物学在线软件分析该基因的保守核苷酸序列，针对ipaH基因的保守区域，结合环介导等温扩增方法的引物设计原则，利用PrimerExplorerV4在线引物设计软件筛选并合成LAMP引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB；S2、DNA模板的制备：制备志贺氏菌菌液，人工污染脱脂奶粉样品，将污染样品梯度稀释，采用热裂解法提取细菌基因组，得到不同浓度的DNA模板溶液；S3、样品的LAMP检测：取步骤S2所得不同浓度的DNA模板分别加入步骤S1所得内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB在LAMP反应体系及反应条件下进行扩增，分别取扩增产物通过直接目测法或琼脂糖凝胶电泳法，判断结果。2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S1所得LAMP引物包括：内引物FIP为TCCGCGACACGTTCCCTCTATTGTCAGTACGCTTCGCC，内引物BIP为TGCCGATTTGAAGGCCGGTACACCGTGGTCCGTTCTGAA，外引物F3为ACTCTCCCAGTGTGCTTTGAT，外引物B3为CTTTTCGTGAAAAATTGAAA，环引物LF为TGGCATGCTTTGAACAGATAA，环引物LB为TATTGAGTTCGTTCTAATCAACT。3.根据权利要求1所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S2包括：将志贺氏菌接种于R&F志贺氏菌属显色培养基，37℃培养16-24h，再挑取单菌落于LB培养液中，37℃、200r/min条件下，振荡培养16-48h，得到所述志贺氏菌菌液。4.根据权利要求3所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S2包括：将所得志贺氏菌菌液接种到脱脂奶粉样品中，10倍梯度稀释所述污染样品，使所述污染样品中志贺氏菌的浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴冰，邱霞，萧绮倩，张任广，郑传发，吉宇恒，
申请(专利权)人：中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44