本发明专利技术提供一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系，所述等温扩增体系包括引物、Bst DNA聚合酶和金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒与引物、Bst DNA聚合酶之间通过吸附结合。本发明专利技术还提供了上述等温扩增体系的扩增方法。本发明专利技术的高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法，能够在常温下将LAMP体系中高浓度的引物吸附在金纳米颗粒表面，同时也能够吸附Bst DNA聚合酶从而抑制其活性，阻止引物之间的错配及延伸，显著提高LAMP的特异性和检测的可靠性。
A High Specificity Hot Start Ring Mediated Isothermal Amplification System and Amplification Method
The present invention provides a highly specific thermal-activated RING-mediated isothermal amplification system, which comprises primers, Bst DNA polymerase and gold nanoparticles, in which the gold nanoparticles are adsorbed and bound to primers and Bst DNA polymerase. The invention also provides an amplification method of the isothermal amplification system. The high specific thermal-activated RING-mediated isothermal amplification system and amplification method of the invention can adsorb high concentration primers in LAMP system on the surface of gold nanoparticles at room temperature, at the same time can adsorb Bst DNA polymerase to inhibit its activity, prevent mismatch and extension between primers, and significantly improve the specificity and extension of LAMP. Reliability of detection.
【技术实现步骤摘要】
一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种便捷高效的具有极高特异性的热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法。
技术介绍
核酸检测作为一种具有高灵敏度及特异性的方法，目前已经广泛应用于许多领域，例如疾病诊断，食品安全，传染病防治等。PCR(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。然而，PCR作为经典的核酸检测方法，其固有的变性-复性-延伸循环，要求其必须需要热循环仪设备作为支撑，因而极大地限制了PCR在床旁快速诊断等领域的应用。为了克服这些缺点，一大类等温核酸扩增的新方法大量出现，其中LAMP是最受关注也是最有应有前景的一种方法。LAMP(环介导等温扩增技术)是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10^9～10^10倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。然而，以LAMP为代表的等温核酸扩增方法均有一个类似的缺点，即有严重的非特异性扩增现象，导致核酸检测时时常出现假阳性问题，极大地限制了等温核酸扩增方法的应用，尤其是限制了LAMP的实际应用。研究发现，造成LAMP假阳性率高的原因主要是：其引物浓度高，长度长，且没有特异性的退火温度，所有的反应均在65℃左右进行，导致引物之间错配及自我延伸的概率极高，且LAMP目前还缺乏特异性荧光探针的检测方法，目前应用的多为非特异性嵌入式荧光的方法，导致难以区别错配延伸和真正目的序列所产生的信号。并且，应用于LAMP的BstDNA聚合酶具有强大的聚合能力，该酶反应的最适温度为65℃，但其在常温下也具有一定的活性，这为引物错配后的延伸造成的假阳性提供了支持。截止目前，还没有一种能够显著改善传统LAMP中的非特异性扩增问题的环介导等温扩增技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法，能够在常温下将LAMP体系中高浓度的引物吸附在金纳米颗粒表面，同时也能够吸附BstDNA聚合酶从而抑制其活性，阻止引物之间的错配及延伸，显著提高LAMP的特异性和检测的可靠性。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系，所述等温扩增体系包括引物、BstDNA聚合酶和金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒与引物、BstDNA聚合酶之间通过吸附结合。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：进一步地，所述金纳米颗粒的颗粒尺寸为5nm～15nm，所述金纳米颗粒的加入量为4ng～100ng。进一步地，选用A群轮状病毒NSP5基因作为模板DNA，采用如SEQIDNO：1所示序列作为靶序列；针对该靶序列，采用如SEQIDNO：2～5所示序列作为引物。进一步地，所述等温扩增缓冲液包括：Tris-HCl(pH8.8@25℃)、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20。进一步地，所述荧光染料为SYBRgreen、SYBRGold、Goldview、GelGreen中的任一种；优选为SYBRgreen。进一步地，所述等温扩增体系为25μL，其中各组分及其浓度为：20mMTris-HCl(pH8.8@25℃)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、8mMMgSO4、0.1％Tween-20、0.2μMF3/B3、1.6μMFIP/BIP、8UBstDNA聚合酶、dNTPs(each1.4mM)、1×SYBRgreen、20ng金纳米颗粒；更进一步地，所述扩增体系中金纳米颗粒的颗粒尺寸为5nm。本专利技术的第二个目的是提供一种高特异性热启动型环介导等温扩增方法，将金纳米颗粒直接加入LAMP反应体系中，金纳米颗粒与引物及BstDNA聚合酶吸附，得到等温扩增体系，以样品DNA为模板进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：进一步地，金纳米颗粒与引物之间通过金与DNA序列中碱基上的氮原子产生亲和吸附，金纳米颗粒与BstDNA聚合酶之间通过正负电荷产生静电吸附。进一步地，所述等温扩增反应的温度为65℃，反应时间为90min。本专利技术的第三个目的是提供一种所述的高特异性热启动型环介导等温扩增体系的试剂盒。本专利技术的第四个目的是提供一种所述的高特异性热启动型环介导等温扩增体系在A群轮状病毒检测中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1)本专利技术所述的高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法，能够显著改善传统LAMP中的非特异性扩增问题，具有极大的应用价值和科学意义。2)金纳米颗粒能够在常温下吸附引物至其表面，防止引物间错配造成的假阳性，并抑制BstDNA聚合酶的活性，从而使得温度升高至65℃时扩增反应才开始进行，显著提高了LAMP扩增的特异性。附图说明图1为本专利技术一实施例中金纳米颗粒介导的热启动-LAMP机理模式图；图2为本专利技术一实施例中采用UV-VIS吸光度法验证分析金纳米颗粒与引物及BstDNA聚合酶的吸附作用分析图；图3为本专利技术一实施例中采用zeta电势法验证分析金纳米颗粒与引物及BstDNA聚合酶的吸附作用分析图；图4为本专利技术一实施例中金纳米颗粒介导的热启动-LAMP的效果验证分析图；图5为本专利技术一实施例中金纳米颗粒的最适加入量和最适颗粒尺寸确定试验的分析图；图6为本专利技术一实施例中大样本验证金纳米颗粒介导的热启动LAMP的检测性能的分析图。具体实施方式本专利技术提供了一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系，所述等温扩增体系包括等温扩增缓冲液、引物、BstDNA聚合酶、dNTP混合物、荧光染料、和金纳米颗粒；本专利技术还提供了上述等温扩增体系的扩增方法；本专利技术还提供了上述扩增体系的试剂盒；本专利技术还提供了上述扩增体系在A群轮状病毒检测中的应用。下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1本实施例以A群轮状病毒为样品，提供一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法。选取特定的A群轮状病毒NSP5基因序列作为靶序列(SEQIDNO：1)；针对该靶序列，设计特异性LAMP引物，引物序列为：SEQIDNO：2～5；直接在扩增体系中加入20ng、颗粒尺寸为5nm的金纳米颗粒(本实验中使用的金纳米颗粒购自商品化试剂(上海羧菲生物医药科技有限公司))，具体扩增体系为25μL，其中各成分浓度为：20mMTris-HCl(pH8.8@25℃)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，8mMMgSO4,0.1％Tween-20，0.2μMF3/B3，1.6μMFIP/BIP，8UBstDNA聚合酶，20ng金纳米颗粒，dNTPs(each1.4mM),1×SYBRgreen，LAMP反应条件为：65℃，90mins，得到环介导等温扩增产物(图1)。实施例2本实施例为采用UV-VIS吸光度法验证分析金本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系，其特征在于，所述等温扩增体系包括引物、Bst DNA聚合酶和金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒与引物、Bst DNA聚合酶之间通过吸附结合。
【技术特征摘要】
1.一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系，其特征在于，所述等温扩增体系包括引物、BstDNA聚合酶和金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒与引物、BstDNA聚合酶之间通过吸附结合。2.根据权利要求1所述的等温扩增体系，其特征在于，所述金纳米颗粒的颗粒尺寸为5nm～15nm，所述金纳米颗粒的加入量为4ng～100ng。3.根据权利要求1所述的等温扩增体系，其特征在于，所述引物采用如SEQIDNO：2～5所示序列。4.根据权利要求1所述的等温扩增体系，其特征在于，所述等温扩增体系中的等温扩增缓冲液包括：Tris-HCl(pH8.8@25℃)、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20。5.根据权利要求1所述的等温扩增体系，其特征在于，所述等温扩增体系为25μL，其中各组分及其浓度为：20mMTris-HCl(pH8.8@25℃)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、8mMMgSO4、0.1％Tween-20、0.2...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶辛，方雪恩，孔继烈，
申请(专利权)人：上海速创诊断产品有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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