检测人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法技术

本发明专利技术涉及检测人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。所述试纸通过双抗体夹心法检测人ST2蛋白，所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一ST2单克隆抗体来源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的一者；并且所述双抗体夹心法采用第二ST2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二ST2单克隆抗体来源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的另一者。本发明专利技术的荧光免疫层析试纸操作简便、快速、检测范围宽、特异性高、灵敏度好。

【技术实现步骤摘要】
检测人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法
本专利技术属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的ST2特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人ST2体外诊断试剂盒上的应用，人ST2体外诊断试剂盒，以及一种用于定量检测待测物中人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。
技术介绍
1989年，可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)作为白介素I受体家族成员之一被发现，之后被证实其参与多种病理生理过程，在炎性和变态反应性疾病中发挥重要作用。但因当时未发现其功能性配体，故长期以来ST2一直被认为是一个孤儿受体，于是针对ST2的研究又有了新的进展。ST2是一种心肌蛋白，直接影响心脏疾病进展的ST2蛋白有两种，可溶性ST2和跨膜形式的STL2。这两种ST2蛋白直接与心脏疾病的进展相关：当可溶性ST2浓度低时，ST2的配体白介素33(IL-33)可与ST2L结合，这对心脏有保护作用。当可溶性ST2水平高时，可溶性ST2可竞争性的与IL-33结合，使IL-33与ST2L结合减少，从而使IL-33无法进入心脏保护的信号转导途径。因此，心脏持续承受压力，导致细胞死亡和组织纤维化，降低了心脏的功能，增加疾病的进展率。机械应力诱导心肌细胞产生血清可溶性ST2后，其阻断了白介素33(IL-33)抗心肌肥大和抗心肌纤维化的作用，是心肌细胞肥厚和纤维化的标志物，且不受年龄、肾功能损害和体重指数的影响。可溶性ST2为一种心肌纤维化的标志物，不但可以预测急性心肌梗死和心力衰竭患者的预后，还可以预测心衰患者的入院和死亡机率，而且还可以在利纳指标之上提供预后信息，其被认为在心力衰竭和其他心血管疾病中具有很高的应用价值。ST2作为生物标志物已经反复被证实具有潜在的价值，测量急性呼吸困难或心肌梗死的急诊患者血清中ST2水平可能为分层护理提供一些有用的预后信息。ST2具有能早期监测出风险、浓度反应即时、数据容易解读等优点，并已获得许可专业认可。ST2诊断可用于发病前筛查，治疗前的指导和参考，治疗中和治疗后的监控及观察。检测血清中的ST2水平的最理想的方法为免疫检测，利用ST2抗体和先进的酶免疫、化学发光技术，通过常规抽血即可检查ST2水平。因此，寻找合适的具有免疫原性的ST2抗原表位肽、制备特异性的ST2抗原及抗体即成了重点。荧光免疫层析方法测血液中的待测物操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品检测，并且检测范围宽，灵敏度好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。中国专利申请No.200910117820.8公开了一种荧光微球免疫层析试纸条的制备方法及定量检测方法；中国专利申请No.200910047352.1公开了一种荧光免疫层析试纸及其制备方法和应用。然而，目前还没有针对人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸。
技术实现思路
为解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术提供了一种用于定量检测待测物中人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。具体而言，本专利技术提供了：一种用于定量检测待测物中人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法检测所述人ST2蛋白，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一ST2单克隆抗体来源于人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且所述双抗体夹心法采用第二ST2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二ST2单克隆抗体来源于人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；所述人ST2抗原表位肽(1)和(2)分别为：(1)Gly-Lys-Asn-Ala-Asn-Leu-Thr-Gln-Gln-Glu-Glu-Gly-Gln-Asn-Gln-Ser-Tyr；(2)Tyr-Lys-Asp-Glu-Thr-Arg-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu。优选地，所述第一ST2单克隆抗体是由第一ST2抗原制备而成的，该第一ST2抗原是通过使所述人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的；并且所述第二ST2单克隆抗体是由第二ST2抗原制备而成的，该第二ST2抗原是通过使所述人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。优选地，所述荧光微球的粒径为320nm至400nm。优选地，所述荧光微球上的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或X-罗丹明等，其中优选为X-罗丹明；所述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。优选地，所述荧光微球的激发波长为350～600nm，优选为390nm；发射波长为500～700nm，优选为615nm。优选地，所述荧光免疫层析试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述结合垫设置有所述的标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有所述第二ST2单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体特异性结合的抗抗体。优选地，所述反应膜为在大于550nm的波长下基本上不发荧光的硝酸纤维素膜。优选地，所述底板基本上不具有荧光性质。优选地，所述抗抗体为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体，其中优选为羊抗鼠IgG单克隆抗体。本专利技术还提供了一种制备所述的用于定量检测待测物中人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：1)提供标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体；2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体；3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二ST2单克隆抗体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述反应膜、吸水滤纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。优选地，所述步骤1)包括：a)用碳二亚胺活化荧光微球，优选地，将荧光微球的水分散液或MES缓冲液分散液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述荧光微球；b)洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光微球用N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液洗涤、分散，并经超声波处理；c)用步骤b)所获得的荧光微球标记第一ST2单克隆抗体，优选地，将步骤b)所获得的荧光微球与第一ST2单克隆抗体混合，用BSA-乙醇胺缓冲液封闭，离心，用BSA-吐温水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体。优选地，在所述步骤2)中，所述的标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体的包被浓度为0.5～2ng/ml。优选地，在所述步骤3)中，所述检测区和所述质控区间隔3mm至8mm。优选地，在所述步骤3)中，所述第二ST2单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0.5～2ng/ml。本专利技术与现有技术相比具有以下优点和积极效果：1.本专利技术的人ST2抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。2.用本专利技术制备的ST2单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的ST2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量检测待测物中人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法检测所述人ST2蛋白，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一ST2单克隆抗体来源于人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且所述双抗体夹心法采用第二ST2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二ST2单克隆抗体来源于人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；所述人ST2抗原表位肽(1)和(2)分别为：(1)Gly‑Lys‑Asn‑Ala‑Asn‑Leu‑Thr‑Gln‑Gln‑Glu‑Glu‑Gly‑Gln‑Asn‑Gln‑Ser‑Tyr；(2)Tyr‑Lys‑Asp‑Glu‑Thr‑Arg‑Val‑Arg‑Leu‑Ser‑Arg‑Lys‑Asn‑Pro‑Ser‑Lys‑Glu。

【技术特征摘要】
1.一种用于定量检测待测物中人ST2蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法检测所述人ST2蛋白，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一ST2单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一ST2单克隆抗体来源于人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且所述双抗体夹心法采用第二ST2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二ST2单克隆抗体来源于人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；所述人ST2抗原表位肽(1)和(2)分别为：(1)Gly-Lys-Asn-Ala-Asn-Leu-Thr-Gln-Gln-Glu-Glu-Gly-Gln-Asn-Gln-Ser-Tyr；(2)Tyr-Lys-Asp-Glu-Thr-Arg-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu。2.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述第一ST2单克隆抗体是由第一ST2抗原制备而成的，该第一ST2抗原是通过使所述人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的；并且所述第二ST2单克隆抗体是由第二ST2抗原制备而成的，该第二ST2抗原是通过使所述人ST2抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。3.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述荧光微球的粒径为320nm至400nm。4.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述荧光微球上的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或X-罗丹明；所述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或由甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物。5.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其中所述荧光微球的激发波长为350～600nm；...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建安，朱仕杰，
申请(专利权)人：深圳市安群生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44