人闭锁蛋白抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及人闭锁蛋白抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒。本发明专利技术的人闭锁蛋白抗原表位肽的氨基酸序列，为序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列之一。本发明专利技术的闭锁蛋白抗原由人闭锁蛋白抗原表位肽与载体蛋白偶联制得。本发明专利技术的闭锁蛋白单克隆抗体或多克隆抗体由本发明专利技术的闭锁蛋白抗原制得。本发明专利技术的闭锁蛋白单克隆抗体或多克隆抗体用于制备闭锁蛋白体外诊断试剂盒。本发明专利技术的人闭锁蛋白抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，从而可应用于人闭锁蛋白的体外检测。

【技术实现步骤摘要】
人闭锁蛋白抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用
本专利技术属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人闭锁蛋白(Occludin)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的闭锁蛋白特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人闭锁蛋白体外诊断试剂盒上的应用、人闭锁蛋白体外诊断试剂盒、以及该试剂盒在定量检测血清中的人闭锁蛋白中的应用。
技术介绍
血脑屏障(bloodbrainbarrier，BBB)是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织。BBB是由毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞、部分神经元、管周细胞、血管内皮细胞间的紧密连接以及基底膜组成。在正常生理条件下，BBB为脑组织选择性通透营养物质，包括氧气，葡萄糖等，并将脑组织的代谢废物过滤到血液中，同时能有效阻止血液的其他成分由毛细血管自由进入脑实质。但一旦发生脑缺血及缺血后的再灌流，BBB的屏障功能会逐渐被破坏。当BBB损伤达到非常严重程度时，组成BBB的毛细血管将严重丧失其结构与功能的完整性，所有的血液成分包括各种血细胞将通过受损的BBB外流进入脑实质，发生脑出血。大多数脑卒中(约占80-85％)是缺血性脑卒中。它是由于急性血栓形成或其它部位的栓子转移，导致局部脑血管闭塞造成的。脑缺血30～90分钟后，不可逆的脑损伤即开始出现。闭锁蛋白(Occludin，也称为咬合蛋白或封闭蛋白)是形成紧密连接结构的重要跨膜蛋白分子，它含有胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域。闭锁蛋白是构成细胞间屏障的重要结构，在维持细胞间的屏障功能发挥重要作用。细胞及动物实验发现，缺血2小时可导致BBB损伤以及BBB的重要结构蛋白闭锁蛋白降解。闭锁蛋白降解后，部分蛋白片段，尤其是包含胞外结构域的片段，可能进入血液循环。如果BBB损伤越严重，越多的闭锁蛋白将被降解，进入血循环的片段也可能随之增加。因此，通过检测血液中闭锁蛋白片段的含量可快速判断血脑屏障(BBB)的受损程度，评估脑出血的风险，对早期的脑卒中早检测早治疗，减少脑出血带来的严重后果。检测血液中的闭锁蛋白最理想的方法是免疫测定。因此，寻找合适的具有免疫原性的闭锁蛋白抗原表位肽、制备特异性的闭锁蛋白抗原及抗体即成为了重点。
技术实现思路
为解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术提供了一种人闭锁蛋白抗原表位肽，用该抗原表位肽制备的闭锁蛋白特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体，其在制备人闭锁蛋白体外诊断试剂盒上的应用，人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，以及该试剂盒在定量检测血清中的人闭锁蛋白中的应用。具体而言，本专利技术提供了：一种人闭锁蛋白抗原表位肽，其中所述闭锁蛋白抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：(1)Thr-Ser-Pro-Val-Asp-Asp-Phe-Arg-Gln-Lys-Pro-Lys-Arg-Tyr。(2)Lys-Gln-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu-Ser-His-Ile-Lys-Lys-Asp-Arg-Tyr。本专利技术还提供了一种闭锁蛋白抗原，其是通过使所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。本专利技术还提供了一种闭锁蛋白抗原，其是通过使所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。本专利技术还提供了一种人闭锁蛋白抗体，其是由所述的闭锁蛋白抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述闭锁蛋白抗原是通过使所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。本专利技术还提供了另一种人闭锁蛋白抗体，其是由所述的闭锁蛋白抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述闭锁蛋白抗原是通过使所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。本专利技术还提供了根据所述的人闭锁蛋白抗体在制备人闭锁蛋白体外诊断试剂盒上的应用。本专利技术还提供了一种人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，其包含所述的人闭锁蛋白抗体作为包被抗体。优选地，所述试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为所述的人闭锁蛋白抗体，并且当所述结合抗体来源于所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。优选地，所述包被抗体为单克隆抗体。优选地，所述结合抗体为多克隆抗体。优选地，所述试剂盒用于定量检测血清中的人闭锁蛋白。本专利技术还提供了根据所述的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒在定量检测血清中的人闭锁蛋白中的应用。本专利技术与现有技术相比具有以下优点和积极效果：1.本专利技术的人闭锁蛋白抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。2.用本专利技术制备的闭锁蛋白单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的闭锁蛋白结合。3.本专利技术的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒可以有效地检测血液中闭锁蛋白的水平，从而评估血脑屏障的受损程度，监测脑出血发生状况，减少脑卒中发生带来的严重后果。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本专利技术作进一步说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本专利技术的基本思想，均在本专利技术的范围之内。一、人闭锁蛋白抗原表位肽本文中所述的人闭锁蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，可以在NCBI等专业数据库中查到，NCBI登录号AAL47094.1。本专利技术提供了人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)，其氨基酸序列分别如序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，为：(1)Thr-Ser-Pro-Val-Asp-Asp-Phe-Arg-Gln-Lys-Pro-Lys-Arg-Tyr。(2)Lys-Gln-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu-Ser-His-Ile-Lys-Lys-Asp-Arg-Tyr。本专利技术的专利技术人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的抗原性的抗原表位肽。闭锁蛋白抗原表位肽(1)以人闭锁蛋白N端第357位至365位的一段含9个氨基酸残基的肽段为抗原决定簇，并且在其C端添加由5个氨基酸构成的亲水性肽段Lys-Pro-Lys-Arg-Tyr，从而构成由14个氨基酸组成的闭锁蛋白抗原表位肽(1)。闭锁蛋白抗原表位肽(2)以人闭锁蛋白C端第501至512位的一段含12个氨基酸残基的肽段为抗原决定簇，并且在其C端添加Asp-Arg-Tyr，从而构成了具有15个氨基酸的闭锁蛋白抗原表位肽(2)。本专利技术的构思和设计使这两个肽段具有良好的亲水性，具有抗原性强并且易于合成的特点。目前，本专利技术研究发现，本专利技术的闭锁蛋白抗原表位肽具有如下功能：1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与人闭锁蛋白结合。本专利技术的闭锁蛋白抗原表位肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肽。本专利技术的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1971.13和2124.44，可用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。肽段的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。二、闭锁蛋白抗原本专利技术还提供了一种闭锁蛋白抗原，其通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人闭锁蛋白抗原表位肽，其中所述闭锁蛋白抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：(1)Thr‑Ser‑Pro‑Val‑Asp‑Asp‑Phe‑Arg‑Gln‑Lys‑Pro‑Lys‑Arg‑Tyr；(2)Lys‑Gln‑Leu‑Lys‑Ser‑Lys‑Leu‑Ser‑His‑Ile‑Lys‑Lys‑Asp‑Arg‑Tyr。

【技术特征摘要】
1.一种人闭锁蛋白抗原表位肽，其中所述闭锁蛋白抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：(1)Thr-Ser-Pro-Val-Asp-Asp-Phe-Arg-Gln-Lys-Pro-Lys-Arg-Tyr；(2)Lys-Gln-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu-Ser-His-Ile-Lys-Lys-Asp-Arg-Tyr。2.一种闭锁蛋白抗原，其是通过使权利要求1所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。3.一种闭锁蛋白抗原，其是通过使权利要求1所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。4.一种人闭锁蛋白抗体，其是由权利要求2所述的闭锁蛋白抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。5.一种人闭锁蛋白抗体，其是由权利要求3所述的闭锁蛋白抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建安，朱仕杰，
申请(专利权)人：深圳市安群生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44