高亲和力的可溶性PD-1分子制造技术

本发明专利技术提供了高亲和力的可溶性PD‑1分子，具体地本发明专利技术提供了一种程序性死亡受体PD‑1分子，其在野生型PD‑1分子的基础上发生了突变，并且所述PD‑1分子与其配体PDL‑1分子的亲和力是野生型PD‑1分子与野生型PDL‑1分子的亲和力的至少2倍。同时，本发明专利技术的PD‑1分子能够有效地提高淋巴细胞的杀伤能力。另外，本发明专利技术还提供了编码本发明专利技术PD‑1分子的核酸，以及本发明专利技术PD‑1分子的复合物。本发明专利技术的PD‑1分子可以单独使用，也可与其他分子联用。

High affinity soluble PD-1 molecules

The invention provides a high affinity soluble PD 1 molecule. The invention provides a programmed death receptor PD, which has a mutation on the basis of the wild type PD 1 molecule, and the affinity of the PD 1 molecule and its ligand PDL 1 molecule is the affinity of the wild type PD 1 molecule and the wild type PDL 1 molecule. At least 2 times the force. Meanwhile, the PD 1 molecule of the invention can effectively improve the killing ability of lymphocytes. In addition, the invention also provides nucleic acids encoding the PD 1 molecule of the invention, and a compound of PD 1 molecule of the invention. The PD 1 molecule can be used alone or in conjunction with other molecules.

【技术实现步骤摘要】
高亲和力的可溶性PD-1分子
本专利技术涉及生物
，更具体地涉及高亲和力的可溶性程序性死亡受体(ProgrammedDeath-1,PD-1)分子能够高亲和地识别程序性死亡受体配体PDL-1(ProgrammedDeathLigand-1,PDL-1)分子。本专利技术涉及该分子的制备方法和用途。
技术介绍
PD-1是在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受体，其配体为PDL-1或PDL-2。PD-1属于B7家族，是大小为50-55kD的Ig超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白；由胞外IgV区、跨膜区、胞内区三部分组成，通过结构和生化分析发现，由于缺少膜近端半胱氨酸残基，PD-1以单体存在(XuewuZhangandAlmo,Immunity,2004,20,337–347)。PD-1与配体PDL-1相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。许多肿瘤细胞系和肿瘤细胞高表达PDL-1分子(KonishiJetal.,Clin.CancerRes.,2004，10(15):5094－5100)，其与淋巴细胞表面的PD-1分子结合后，削弱了机体的抗肿瘤免疫应答(RadziewiczHetal.,JVirol，2007,81(6):2545－2553)，从而导致肿瘤免疫逃逸的发生。研究发现在宫颈癌和肝癌中，有近半数的肿瘤浸润CD8+T细胞表达PD-1分子，其与肿瘤细胞表达的PDL-1结合后，可能导致CTL细胞的耗尽及凋亡(DongHetal.,JMolMed(Berl)，2003，81(5):281－287；KarimRetal.,ClinCancerRes,2009,15(20):6341-6347；ZhaoQetal.,EurJImmunol,2011,41(8):2314－2322)。针对上述肿瘤免疫逃逸问题，阻断淋巴细胞表面的PD-1与肿瘤细胞表面的PDL-1的相互作用可使淋巴细胞的免疫性提高，因此，有助于由免疫系统清除肿瘤细胞。针对这一问题，研究人员已进行了大量研究。在侵袭性胰腺癌的鼠模型中，T.Nomi等(Clin.CancerRes.2007,13：2151-2157)证明阻断PD-1与PDL-1相互作用的治疗功效。本领域技术人员致力于研究PDL-1与PD-1的相互作用，以期找到提高淋巴细胞杀伤能力的有效途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对PDL-1分子具有较高亲和力的PD-1分子。本专利技术的再一目的是提供一种上述高亲和力的PD-1分子的制备方法及用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种PD-1分子，所述PD-1分子在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列中含有突变。在另一优选例中，所述PD-1分子的氨基酸序列基于SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列，并且对SEQIDNO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变或氨基酸残基的插入从而获得所述PD-1分子。在另一优选例中，所述PD-1分子的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有至少90％(优选地，至少92％；更优选地，至少94％)的序列相同性。在另一优选例中，所述PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力的至少2倍；优选地，至少10倍；更优选地，至少100倍；最优选地，至少200倍。在另一优选例中，所述PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力的至少500倍；优选地，至少1000倍；更优选地，至少2000倍。在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点为30～60、和/或85～105位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点为31～37、40～48、56、和/或89～103位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点的数量为n，其中1≤n≤15；优选地，2≤n≤11；更优选地，2≤n≤6，如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括31V、33N、35Y、37M、40S、41N、42Q、43T、48A、56P、89L、91G、92A、93I、95L、97P、98K、99A、100Q、101I、103E中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括91G，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括99A，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点还包括41N、42Q、43T、48A、95L、97P、98K、和/或100Q，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，突变后的PD-1分子包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：31T；33L；35N、或35M；37V、37L或37E；40A、或40T；41G、或41L；42N；43V、或43G；48G、或48S；56L；89M；91A、91S、91V或91T；92V、或92Y；93L；95W、或95F；97G；98R、98Y或98P；99P、99V、99I或99F；100S、或100W；101V；和103D；其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，突变后的PD-1分子包括91V、或91S。在另一优选例中，突变后的PD-1分子还包括99I、或99P。在另一优选例中，所述PD-1分子包括：91V、和99I；或91S、98Y、和99I；或41L、42N、43G、48S、91V、和99P；或41G、43V、48G、91V、和99P,其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，所述PD-1分子的氨基酸序列选自SEQIDNO.5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、或43。在另一优选例中，所述PD-1分子是可溶的。在另一优选例中，所述PD-1分子的C或N末端结合有偶联物。在另一优选例中，与所述PD-1分子结合的偶联物为T细胞受体，优选地，所述T细胞受体为高亲和性T细胞受体。本专利技术的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括本专利技术第一方面所述的PD-1分子。在另一优选例中，所述融合蛋白还包括IgG4。本专利技术的第三方面，提供了一种多价PD-1复合物，所述多价PD-1复合物包含至少两个PD-1分子，并且其中的至少一个PD-1分子为本专利技术第一方面所述的PD-1分子；或者所述多价PD-1复合物包含至少一个本专利技术第二方面所述的融合蛋白。本专利技术的第四方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本专利技术第一方面所述的PD-1分子、本专利技术第二方面所述的融合蛋白、或本专利技术第三方面所述的多价PD-1复合物的核酸序列或其互补序列。本专利技术第五方面，提供了一种载体，所述的载体含有本专利技术第四方面所述的核酸分子。本专利技术的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PD‑1分子，其特征在于，所述PD‑1分子的氨基酸序列基于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变从而获得所述PD‑1分子；所述PD‑1分子的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有至少90％的序列相同性；更优选地，所述PD‑1分子与PDL‑1分子的亲和力是野生型PD‑1分子与PDL‑1分子的亲和力的至少2倍。

【技术特征摘要】
1.一种PD-1分子，其特征在于，所述PD-1分子的氨基酸序列基于SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，并且对SEQIDNO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变从而获得所述PD-1分子；所述PD-1分子的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有至少90％的序列相同性；更优选地，所述PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力的至少2倍。2.如权利要求1所述的PD-1分子，其特征在于，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点为第30～60、和/或85～105位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。3.如权利要求1所述的PD-1分子，其特征在于，突变的氨基酸残基位点的数量为n，其中1≤n≤15；优选地，2≤n≤11；更优选地，2≤n≤6，如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。4.如权利要求1所述的PD-1分子，其特征在于所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括31V、33N、35Y、37M、40S、41N、42Q、43T、48A、56P、89L、91G、92A、93I、95L、97P、98K、99A、100Q、101I、和103E中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。5.如权利要求1所述的PD-1分子，其特征在于，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括91G，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号；和/或所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点包括99A，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号；优选地，所述PD-1分子中突变的氨基酸残基位点还包括41N、42Q、43T、48A、95L、97P、98K、和/或100Q，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。更优选地，所述PD-1分子包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：31T；33L；35N、或35M；37...

【专利技术属性】
技术研发人员：李懿，李艳艳，
申请(专利权)人：广东香雪精准医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44