在免疫显性腺病毒抗原表位中具有突变的溶瘤腺病毒及其在癌症治疗中的用途制造技术

本发明专利技术涉及具有腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的功能性缺失的溶瘤腺病毒，以及使用该溶瘤腺病毒来治疗诸如癌症等疾病的方法。该溶瘤腺病毒还可包括各自编码肿瘤抗原或表位的一种或多种异源核酸序列。该溶瘤腺病毒还可包括用于赋予选择性和抗肿瘤效力的DNA序列的其它突变和插入。本发明专利技术应用于癌症治疗领域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在免疫显性腺病毒抗原表位中具有突变的溶瘤腺病毒及其在癌症治疗中的用途
本专利技术的领域大体涉及一种具有腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的功能性缺失的溶瘤腺病毒，以及使用该溶瘤腺病毒来治疗诸如癌症等疾病的方法。
技术介绍
目前，癌症治疗主要是基于化疗、放疗和手术。尽管早期实施治疗的成功率高，但大多数晚期疾病由于无法通过手术切除肿瘤或可给药的放疗和化疗剂量受限于对正常细胞的毒性而无法治愈。为了缓解这个问题，开发了追求更高选择性和效力的生物技术策略。其中，基因疗法和病毒疗法使用对癌症具有治疗目标的病毒。在基因疗法中，对病毒进行修饰以避免其复制并用作治疗性遗传物质的媒介物或载体。另一方面，病毒疗法使用在肿瘤细胞中选择性复制和增殖的病毒。在病毒疗法中，肿瘤细胞是由于细胞内的病毒复制引起细胞病变效应而死亡，而不是由治疗基因的作用而死亡。在肿瘤细胞中的优先复制称为溶瘤作用。虽然在广泛意义上，词语“溶瘤”可用于能够裂解肿瘤细胞的任何可复制的病毒(甚至无选择性)；但在严格意义上，只有在肿瘤中选择性复制的病毒才被称为溶瘤病毒。在本说明书中，术语“溶瘤”在两种意义下使用。免疫疗法是基于利用免疫系统来消除肿瘤。治疗的主要观念是刺激或恢复免疫系统识别肿瘤细胞并激活效应细胞以选择性破坏它们的能力。不同的免疫疗法分为以下两组：a)被动疗法，其目的在于提高已有的抗肿瘤免疫力；和b)主动疗法，其涉及直接刺激患者免疫系统来引起抗肿瘤免疫应答。被动免疫疗法包括阻断抑制免疫系统信号的单克隆抗体，例如，易普利姆玛(Ipilimumab)(CTLA-4)、纳武单抗(Nivolumab)(PD-1)或MDX-1105(PD-L1)(Pardoll,D.M.,NatRevCancer.2012Mar；12(4):252-64)。在该组中，我们还发现自体T细胞的转移。有若干种赋予抗肿瘤能力的技术，但都涉及一定程度的细胞离体操作。细胞离体操作包括：a)刺激针对肿瘤抗原的细胞并特异性地扩增这些细胞；b)通过插入针对肿瘤相关抗原的转基因的高亲和力T细胞受体(TCR)或将TCR替换为嵌合抗原受体(CAR)，来引入肿瘤特异性受体(Kalos,M.andJune,C.H.,Immunity2013Jul25；39(1):49-60)。在主动疗法的情况下，一种方法是在体内重新激活或重新刺激患者的免疫系统。例如，数十年来，已经使用免疫刺激细胞因子IL-2来治疗黑素瘤和肾癌(Amin,A.andWhite,R.L.Jr.,Oncology(WillistonPark).2013；112(277):680-91)。此外，已经在癌症治疗中使用了TNF-α(vanHorssen,R.,etal.,Oncologist.2006Apr；11(4):397-408)以及I型和II型IFN(Kotredes,K.P.andGamero,A.M.,JInterferonCytokineRes.2013Apr；33(4):162-70)。最后，近年来发展更多的领域之一是治疗性疫苗(Myc,L.A.,etal.,ArchImmunolTherExp(Warsz).2011Aug；59(4):249-59)。已经有大量制剂用于免疫，包括：基于DNA的疫苗(Bei,R.andScardinoA.,JBiomedBiotechnol.2010；2010:102758)、基于肽的疫苗(Arens,R.,etal.,SeminImmunol.2013Apr；25(2):182-90；Vacchelli,E.,etal.,Oncoimmunology.2012Dec1；1(9):1557-1576)、基于树突状细胞的疫苗(Bonaccorsi,I.,etal.,ImmunolLett.2013Sep-Oct；155(1-2):6-10；Palucka,K.andBanchereau,J.,Immunity.2013Jul25；39(1):38-48)和基于病毒载体的疫苗(Larocca,C.andSchlom,J.,CancerJ.2011Sep-Oct；17(5):359-71)。尽管已经做出了很大努力，这一类型的疗法的效果仍然有限。要克服的主要障碍是肿瘤免疫抑制以及所诱导的应答的效能和特异性。癌症病毒疗法的使用时间比基因疗法更长。第一例关于用病毒治愈癌症的报道追溯至上世纪初。在1912年，DePace在宫颈癌中接种狂犬病毒后肿瘤发生消退(DePaceN.,Ginecologia1912；9:82-89)。自1912年DePace以来，已经将许多类型的病毒注射到肿瘤中来治疗它们。存在表现出天然趋瘤性的病毒，例如，自主性细小病毒、水疱性口炎病毒和呼肠孤病毒。其它病毒可经基因操作来实现在肿瘤中的选择性复制。例如，已经通过缺失核糖核苷酸还原酶基因，对于在诸如肿瘤细胞中进行活跃增殖来说不必要的酶活性，而赋予了单纯疱疹病毒(HSV)趋瘤性。然而，腺病毒由于其低致病性和感染肿瘤细胞的高效力，而成为癌症病毒疗法和基因疗法中最为常用的病毒。在癌症病毒疗法中使用复制型病毒是基于以下想法：作为病毒复制的结果，肿瘤被破坏并且所释放的病毒后代感染周围的细胞。多轮复制后，实现了肿瘤的完全破坏。原则上，最初仅感染少数细胞，但病毒复制效果产生链式反应，这样病毒扩散遍及整个肿瘤块。一旦病毒到达并感染周围的正常细胞，病毒就由于其肿瘤选择性而不能在它们中复制，正常组织不会受到致病影响。在选择用于癌症病毒疗法的病毒种类时，要考虑不同的方面。腺病毒是具有二十面体衣壳的直径为70～90nm的无包膜病毒。它们的基因组是大小范围为25～45千碱基的线性、双链DNA，在两个末端处具有反向末端重复(ITR)，且具有附于5'末端的末端蛋白(Russell,W.C.,JGenVirol200990:1-20)。腺病毒具有裂解性复制周期，从而杀死它们在其中复制的细胞。此外，对腺病毒生物学的广泛了解和操作腺病毒DNA的可能性使得易于通过几种策略赋予选择性，改善诸如肿瘤细胞感染性等其它特征，并增加溶瘤效力。另外，腺病毒是在具有免疫能力的患者中具有非常低的突变率和非常温和的病理学的病毒。此外，腺病毒的复制能力高，这使得它能以高度浓缩的量(1012～1013病毒颗粒(vp)/mL)产生。二十面体衣壳通过三种主要蛋白形成，其中六邻体三聚体是最丰富的(Nemerow,G.R.,etal.Virology2009384:380-8)。衣壳的十二个顶点中各自还包含五聚体蛋白，共价连接至纤维的五邻体基底。纤维是从五邻体基底突出的三聚体蛋白质，是一种有节的棒状结构。其它病毒蛋白IIIa、IVa2、VI、VIII和IX同样与病毒衣壳相关联。蛋白VII、小肽mu和末端蛋白(TP)与DNA相关联。蛋白V经由蛋白VI提供至衣壳的结构连接。六邻体蛋白是最丰富的衣壳蛋白并占病毒总蛋白质质量的63％。蛋白具有定义明确的不同结构区域。V1和V2结构域形成每个亚基的基底。这些结构域采用“双筒(doublebarrel)”或“双卷(doublejellyroll)”构造，并产生伪六面体同源三聚体形式，这允许病毒壳体的更大的组装。这些结构由底部的VC区和上半部分的环DE2隔开。这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒包含腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的至少一个功能性缺失。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.04 US 62/156,7481.一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒包含腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的至少一个功能性缺失。2.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒，其中，所述免疫显性T细胞表位是人淋巴细胞抗原(HLA)I类限制性表位。3.根据权利要求2所述的溶瘤腺病毒，其中，所述免疫显性T细胞表位是人淋巴细胞抗原A2.1(HLA-A2.1)限制性表位。4.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒，其中，所述免疫显性T细胞表位是HLAII类限制性表位。5.根据权利要求1至4中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，与缺少所述至少一个缺失的亲代腺病毒相比，所述至少一个缺失与大幅降低的细胞毒性或大幅降低的病毒复制无关。6.根据权利要求1至5中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒蛋白选自由以下项组成的组：E1A、E1B、六邻体、五邻体基底、纤维蛋白、衣壳蛋白IX、DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白。7.根据权利要求6所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒蛋白是腺病毒六邻体蛋白。8.根据权利要求7所述的溶瘤腺病毒，其中，所述免疫显性T细胞表位在所述腺病毒六邻体蛋白的保守的基底区中。9.根据权利要求8所述的溶瘤腺病毒，其中，所述免疫显性T细胞表位选自由以下项组成的组：Hex512(GLVDCYINL)(SEQIDNO:23)，Hex713(YLNHTFKKV)(SEQIDNO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQIDNO:15)，和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQIDNO:19)。10.根据权利要求8所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含选自由以下项组成的组中的至少一个突变：Hex512表位中的L520P突变，Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K突变。11.根据权利要求8所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含免疫显性T细胞表位Hex512(GLVDCYINL)(SEQIDNO:23)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQIDNO:19)的缺失。12.根据权利要求11所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含Hex512表位中的L520P突变和Hex917表位中的V925K突变。13.根据权利要求11所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含免疫显性T细胞表位Hex713(YLNHTFKKV)(SEQIDNO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQIDNO:15)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQIDNO:19)的缺失。14.根据权利要求13所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K突变。15.根据权利要求13所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含免疫显性T细胞表位Hex512(GLVDCYINL)(SEQIDNO:23)，Hex713(YLNHTFKKV)(SEQIDNO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQIDNO:15)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQIDNO:19)的缺失。16.根据权利要求15所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含Hex512表位中的L520P突变，Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K突变。17.根据权利要求1至16中任一项所述的溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒进一步包括各自编码肿瘤抗原或表位的一种或多种异源核酸序列。18.根据权利要求17所述的溶瘤腺病毒，其中，所述一种或多种异源核酸序列包括各自编码肿瘤抗原或表位的1至5种异源核酸序列。19.根据权利要求17或18所述的溶瘤腺病毒，其中，所述肿瘤抗原或表位选自由以下项组成的组：MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、酪氨酸酶、中期因子、BAGE、CASP-8、β-连环蛋白、CA-125、CDK-1、ESO-1、gp75、gp100、MART-1、MUC-1、MUM-1、p53、PAP、PSA、PSMA、ras、trp-1、HER-2、TRP-1、TRP-2、IL13Rα、IL13Rα2、AIM-2、AIM-3、NY-ESO-1、C9orf1l2、SART1、SART2、SART3、BRAP、RTN4、GLEA2、TNKS2、KIAA0376、ING4、HSPH1、C13orf24、RBPSUH、C6orf153、NKTR、NSEP1、U2AF1L、CYNL2、TPR、SOX2、GOLGA、BMI1、COX-2、EGFRvIII、EZH2、LICAM、活素、MRP-3、巢蛋白、OLIG2、ART1、ART4、B-细胞周期蛋白、Gli1、Cav-1、组织蛋白酶B、CD74、E-钙粘蛋白、EphA2/Eck、Fra-1/Fosl1、GAGE-1、神经节苷脂/GD2、GnT-V、β1,6-N、Ki67、Ku70/80、PROX1、PSCA、SOX10、SOX11、生存素、UPAR、间皮素和WT-1，或它们的表位。20.根据权利要求17至19中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述肿瘤抗原或表位是人肿瘤抗原或表位。21.根据权利要求17至20中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述异源核酸序列插入到腺病毒基因中，其中所述腺病毒基因编码具有免疫显性T细胞表位的至少一个缺失的腺病毒蛋白。22.根据权利要求17至20中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述异源核酸序列插入到腺病毒基因中，其中，所述腺病毒基因编码除具有免疫显性T细胞表位的至少一个缺失的腺病毒蛋白之外的其它腺病毒蛋白。23.根据权利要求17至22中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述异源核酸序列插入到编码腺病毒六邻体蛋白的腺病毒基因中。24.根据权利要求23所述的溶瘤腺病毒，其中，所述异源核酸序列插入到所述腺病毒六邻体蛋白的高变区中。25.根据权利要求24所述的溶瘤腺病毒，其中，所述高变区是高变区5。26.根据权利要求17至25中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述肿瘤抗原或表位的两侧是柔性连接子。27.根据权利要求26所述的溶瘤腺病毒，其中，所述柔性连接子包括选自由以下项组成的组中的氨基酸序列：GSGSR(SEQIDNO:28)、AGSGSR(SEQIDNO:29)和AGSGS(SEQIDNO:30)。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：莱蒙·阿莱马尼，拉鲁·吉尔，米里阿姆·巴赞，
申请(专利权)人：VCN生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：西班牙,ES