T细胞和高亲和力PD-1融合蛋白的组合制造技术

本发明专利技术公开了特异性识别NY‑ESO‑1的T细胞和高亲和力PD‑1融合蛋白的组合。所述组合实现TCR‑T过继细胞治疗和免疫检测点疗法的联合，从而解决了高亲和力TCR‑T过继免疫疗法无法克服PD‑1信号通路介导的抑制作用的难题，达到了单药治疗无法达到的优异治疗效果并显著限制了肿瘤细胞的生长。

【技术实现步骤摘要】
T细胞和高亲和力PD-1融合蛋白的组合
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域；具体地说，本专利技术涉及T细胞受体转导的T细胞与高亲和力PD-1融合蛋白的组合以及这种组合在预防和治疗癌症中的应用。
技术介绍
T细胞受体转导的T细胞(TCR-T)过继免疫治疗是近年来迅速发展的肿瘤治疗方法。该方法将对靶细胞抗原具有特异的反应性T细胞转入病人体内，使其针对靶细胞发挥作用。T细胞受体(TCR)是T细胞表面的一种膜蛋白，其能够识别相应的靶细胞表面的抗原短肽。在免疫系统中，通过抗原短肽特异性的TCR与短肽-主要组织相容性复合体(pMHC复合物)的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的接触。然后T细胞及APC两者的其它细胞膜表面分子发生相互作用，引起一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。尤其是，当TCR识别pMHC复合物的亲和力被进一步提高后，能够更加高效的识别肿瘤细胞表面的靶标抗原，进而更有效地清除肿瘤细胞。短肽SLLMWITQC源自于被多种肿瘤细胞表达的NY-ESO-1蛋白(Chenetal.,PNASUSA，94,1914-1918)。肿瘤细胞的I型HLA分子呈递包括SLLMWITQC在内的源自NY-ESO-1的短肽。因此，SLLMWITQC-HLAA2复合物提供了一种TCR可靶向肿瘤细胞的标记。能够结合SLLMWITQC-HLAA2复合物的TCR对肿瘤的治疗具有很高的应用价值。过继转输后的T细胞如何进入肿瘤微环境中是一项难题。其中T细胞负向共刺激分子的抑制性通路会被肿瘤利用来对抗免疫系统，使其逃脱机体免疫系统的监控和攻击。PD-1(Programmeddeath1)及其配体PD-L1(Programmeddeath-ligand1)属于CD28/B7超家族蛋白，是一种重要的免疫抑制分子，可截断T细胞活化信号，抑制T细胞增殖及细胞因子的释放，在肿瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病及病毒感染过程中发挥重要作用(KeirMEetal.,AnnuRevImmunol,26,677-704)。在前期的研究中发现，高亲和力PD-1分子能够以较野生型PD-1分子更高的亲和力识别肿瘤细胞表面的PD-L1和PD-L2，阻断PD-1信号通路，逆转PD-1信号通路介导的T细胞抑制。本领域急需能够增强过继转输后的T细胞对肿瘤的杀伤作用，进而提高T细胞的治疗作用的技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种组合，该组合能够增强过继转输后的T细胞对肿瘤的杀伤作用。本专利技术的目的还在于提供这样的组合在制备预防和治疗肿瘤的药物以及这样的组合在预防和治疗癌症中的应用。在第一方面，本专利技术提供一种组合，包括T细胞和高亲和力PD-1融合蛋白，所述高亲和力PD-1融合蛋白包含高亲和力PD-1分子和IgG分子的Fc片段，其中：(i)所述高亲和力PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的至少100倍；和(ii)所述高亲和力PD-1分子的氨基酸序列与野生型PD-1氨基酸序列(SEQIDNO:1)有至少90％的序列相同性。在优选的实施方式中，所述高亲和力PD-1分子的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有92％；优选地，至少94％(例如，95％、96％、97％、98％和99％)的序列相同性。在优选的实施方式中，所述高亲和力PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的亲和力的至少200倍；优选地，至少500倍；更优选地，至少1000倍；更优选地，至少2000倍。在优选的实施方式中，所述PD-1分子的氨基酸序列选自SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31。在优选的实施方式中，所述PD-1分子的氨基酸序列选自SEQIDNO:15、16、28、30或31。在具体的实施方式中，所述高亲和力PD-1融合蛋白中的高亲和力PD-1分子位于IgG分子的Fc片段的N端。在具体的实施方式中，所述的IgG的Fc片段选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段；优选地，选自IgG4的Fc片段。在优选的实施方式中，所述Fc片段包括铰链区、CH2和CH3结构域，优选地，所述Fc片段不包含CH1和CH4结构域，更有选地，所述Fc片段的氨基酸序列为SEQIDNO:32。在具体的实施方式中，所述高亲和力PD-1融合蛋白的氨基酸序列选自SEQIDNO:2、3、33、34或35；优选地，所述高亲和力PD-1融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2或3。在优选的实施方式中，所述融合蛋白中包含两个高亲和力的PD1分子。在优选的实施方式中，所述融合蛋白中两个高亲和力的PD1分子通过二硫键连接形成二聚体结构；优选地，所述二硫键是IgG分子的Fc片段铰链区的二硫键。在具体的实施方式中，所述T细胞含有编码高亲和力TCR的核酸并表达高亲和力TCR。在具体的实施方式中，所述T细胞含有编码特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR的核酸并表达特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR。在具体的实施方式中，所述特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR具有结合SLLMWITQC-HLAA2复合物的活性，所述特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域包含3个CDR区，所述TCRα链可变域的3个CDR区的基准序列如下，CDR1α：TSINNCDR2α：IRSNERECDR3α：ATDANGKII，并且含有至少一个下列突变：和/或，所述TCRβ链可变域包含3个CDR区，所述TCRβ链可变域的3个CDR区的基准序列如下，CDR1β：SGHDYCDR2β：FNNNVPCDR3β：ASSLGSNEQY，并且含有至少一个下列突变：突变前的残基突变后的残基CDR2β的第3位NHCDR2β的第4位NGCDR2β的第5位VACDR2β的第6位PVCDR3β的第3位SQ或MCDR3β的第4位LR或K或M，和CDR3β的第6位SA或G或P。在具体的实施方式中，所述特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR的α链可变域包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列有至少90％的序列同源性的氨基酸序列；和/或所述特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR的β链可变域包含与SEQIDNO:5所示的氨基酸序列有至少90％的序列同源性的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述特异性识别NY-ESO-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合，包括T细胞和高亲和力PD-1融合蛋白，所述高亲和力PD-1融合蛋白包含高亲和力PD-1分子和IgG分子的Fc片段，其特征在于，/n(i)所述高亲和力PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的至少100倍；和/n(ii)所述高亲和力PD-1分子的氨基酸序列与野生型PD-1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少90％的序列相同性。/n

【技术特征摘要】
1.一种组合，包括T细胞和高亲和力PD-1融合蛋白，所述高亲和力PD-1融合蛋白包含高亲和力PD-1分子和IgG分子的Fc片段，其特征在于，
(i)所述高亲和力PD-1分子与PDL-1分子的亲和力是野生型PD-1分子与PDL-1分子的至少100倍；和
(ii)所述高亲和力PD-1分子的氨基酸序列与野生型PD-1氨基酸序列(SEQIDNO:1)有至少90％的序列相同性。


2.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述高亲和力PD-1融合蛋白中所述高亲和力PD-1分子位于IgG分子的Fc片段的N端。


3.如权利要求1或2所述的组合，其特征在于，所述的IgG的Fc片段选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段；优选地，选自IgG4的Fc片段。


4.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述高亲和力PD-1融合蛋白的氨基酸序列选自SEQIDNO:2、3、33、34或35；优选地，所述高亲和力PD-1融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2或3。


5.如权利要求1或2所述的组合，其特征在于，所述T细胞含有编码高亲和力TCR的核酸并表达高亲和力TCR。


6.如权利要求5所述的组合，其特征在于，所述T细胞含有编码特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR的核酸并表达特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR。


7.如权利要求6所述的组合，其特征在于，所述特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR具有结合SLLMWITQC-HLAA2复合物的活性，
所述特异性识别NY-ESO-1的高亲和力TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域包含3个CDR区，所述TCRα链可变域的3个CDR区的基准序列如下，
CDR1α：TSINN
CDR2α：IRSNERE
CDR3α：ATDANGKII，并且含有至少一个下列突变：






和/或，所述TCRβ链可变域包含3个CDR区，所述TCRβ链可变域的3个CDR区的基准序列如下，
CDR1β：SGHDY
CDR2β：FNNNVP
CDR3β：ASSLGSNEQY，并且含有至少一个下列突变：

【专利技术属性】
技术研发人员：李懿，李艳艳，
申请(专利权)人：广东香雪精准医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44