一种高通量检测牛常见遗传缺陷的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种高通量检测牛常见遗传缺陷的引物组及试剂盒。本发明专利技术提供了引物组甲，由序列1至20所示的20种引物组成。本发明专利技术还提供了引物组乙，由扩增引物组和延伸引物组组成；扩增引物组为引物组甲；延伸引物组由序列21至30所示的10种引物组成。本发明专利技术还保护引物组甲或引物组乙在制备试剂盒中的应用；试剂盒的功能为鉴定待测牛是否为多种牛遗传缺陷的携带者。本发明专利技术建立了一种高通量、快速的检测牛主要遗传缺陷的分型方法，为牛遗传缺陷的分子筛查提供一种新方法，提高了检测效率，有助于成果的转化应用，为在今后的育种工作中有计划地降低遗传缺陷基因频率提供了技术支撑，为奶牛场进行科学的选种选配提供了依据。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测牛常见遗传缺陷的引物组及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高通量检测牛常见遗传缺陷的引物组及试剂盒。
技术介绍
在奶牛育种中，由于后裔测定、基因组选择等现代育种技术的应用，在极大地提高了选择准确性的同时，也潜在地提高了选择强度。由于人工授精(AI)等繁殖生物技术的应用，使个别优秀种公牛得到广泛使用，增加了群体的近交系数，降低了有效群体含量，隐性基因纯合的概率加大，使不良基因在奶牛群体中不断出现。近年来，为了提高奶牛的生产性能，我国大量从国外引进遗传物质，促进了国内奶牛群体的遗传改良。然而，在引进遗传物质的过程中也导致了一些遗传缺陷在我国奶牛群体的传播，这导致近年来奶牛育种工作者在重视优秀种公牛生产性能表现的同时，更加重视优秀种公牛是否携带一些不良隐性基因的影响。牛脊柱畸形综合征(ComplexVertebralMalformation，CVM)是由常染色体上SLC35A3基因第4外显子(exon4)的第559位的单碱基突变(G/T)引起的，该碱基突变是错义突变，导致第180位氨基酸的改变(Val→Phe)，CVM呈隐性遗传,纯合时可以造成妊娠早期流产、死胎或犊牛出生后很快死亡，患畜最显著的特征为脊椎弯曲畸形、两前腿筋腱缩短、颈短、心脏畸形等综合症状。牛白细胞黏附缺陷症(BovineLeukocyteAdhesionDeficiency，BLAD)是一种常染色体上单基因控制的隐性遗传缺陷疾病,是由CD18基因第2外显子(exon2)的第55位的单碱基突变(A/G)引起的,该突变是错义突变,使128位天门冬氨酸变成甘氨酸,导致白细胞表面的β2整合素表达明显减少或缺乏而引起临床发病。临床表现为严重的重复性感染、脓液形成减弱、伤口愈合延迟和白细胞增多为主要特征，也表现在犊牛初生重低和发育不良等症状。牛尿苷酸合成酶缺失症(bovinedeficiencyofuridinemonophosphatesynthase，DUMPS)，是在荷斯坦和红荷斯坦牛群中存在一个隐性遗传缺陷基因，纯合时可以造成40天左右胚胎早期流产。DUMPS是由常染色体上UMPS(UridineMonophosphateSynthase)基因第5外显子(exon5)的第55位的单碱基突变(C/T)引起的，该碱基突变是无义突变，导致氨基酸编码序列的终止(Arg405stop)。牛并趾症(Syndactyly)，也称为骡蹄症(Mule-foot，MF)，是一种常染色体的隐性遗传病，但在不同品种中表现不同的外显率，感染者一般一只或多只蹄子均可表现骡蹄。Duchesne(2006)对36个患有骡蹄症的荷斯坦母牛进行了研究，发现所有患病个体的低密度脂蛋白受体结合蛋白(LowDensityLipoproteinReceptor—relatedProtein4，LPR4)基因第33外显子第26-27位碱基发生了两个连续突变(CG/AT)，导致LRP4蛋白的两个遗传密码发生发改变，改变了保守性的类表皮样生长因子蛋白的结构。由于两个突变为紧密连锁的连续突变，实际应用中可直接检测LPR4基因第33外显子的第26位的单碱基突变C/A。牛瓜氨酸血症(Citrullinemia，CN)是荷斯坦牛中的一种常染色体上基因突变引起的隐形遗传缺陷疾病。患病犊牛主要表现为血液和尿液中瓜氨酸含量升高，尿素循环受阻引起高氨血症，从而导致犊牛在出生一周内死亡。该病的致病机理为ASS基因的表达缺陷所致，其分子遗传学基础是位于奶牛第11号染色体(BTA11)上ASS基因的第4外显子(exon4)的第82位的单碱基突变(C/T)引起，导致ASS基因表达缺陷而引起疾病的发生。牛蜘蛛腿综合征(Arachnomeliasyndrome,AS)是一种先天性致死性遗传疾病，患病犊牛体重较轻，头部、背部和四肢骨骼均表现畸形，出生时或出生不久后死亡。该遗传缺陷疾病主要存在于德系西门塔尔牛和瑞士褐牛群体中。在瑞士褐牛群体中，AS是由位于牛第5号染色体BTA5上的SUOX基因外显子4上的一个G碱基的插入c.363-364insG突变所致。插入突变会导致亚硫酸盐氧化酶的氨基酸序列从124位发生移码突变,提前产生终止密码子，导致发病。在西门塔尔牛群体中，AS是由位于牛23号染色体上的MOCS1基因外显子11上的一个2bp缺失突变c.1224_1225delCA引起的，该突变将造成移码突变，产生不成熟的短链蛋白，导致MoaC结构域丢失，进而引起编码的蛋白MOCS1A功能丧失。无论在哪个群体该遗传疾病的爆发都源于大量使用携带者公牛冻精造成致病基因的广泛传播，从而导致患病犊牛的出现。HH1单倍型是在荷斯坦牛群体中发现一种新的遗传缺陷单倍型，隐性基因纯合时导致奶牛胚胎早期流产，严重影响奶牛的繁殖。分子遗传基础是牛5号染色体上APAF1基因第11外显子(exon11)的第127位的单碱基突变(C/T)引起的，该无义突变使编码谷氨酰胺的密码子突变为终止密码子，导致APAF1基因编码的蛋白质缺失约1/3而丧失其功能所导致。HH3单倍型是在荷斯坦牛群体中发现一种新的遗传缺陷单倍型，隐性基因纯合时导致奶牛胚胎早期流产，严重影响奶牛的繁殖。牛8号染色体SMC2基因第24外显子(exon24)的第135位的单碱基突变(T/C)引起的，导致编码的氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸，SMC2基因在染色体结构的维持和DNA的修复中起关键作用，突变导致SMC2基因功能异常，最终导致胚胎死亡。HH4单倍型是在荷斯坦牛群体中发现一种新的遗传缺陷单倍型，隐性基因纯合时导致奶牛胚胎早期流产，严重影响奶牛的繁殖。HH4遗传缺陷单倍型的致病机理是牛1号染色体的GART基因第11外显子(exon11)的第58位的单碱基突变(A/C)引起的，导致编码氨基酸从天冬酰胺突变为苏氨酸。由于GART基因编码甘氨酰胺核苷酸转甲酰基转移酶，而该物质在嘌呤的生物合成中起关键作用，发生突变后GART功能丧失，使得嘌呤无法合成，最终导致胚胎在妊娠早期死亡。我国对奶牛遗传缺陷基因已开展了相关的研究和检测工作，但基本都是基于单遗传缺陷的诊断，严重制约了检测效率及成果的转化应用。现有技术中，牛遗传缺陷主要诊断方法为：PCR(PolymeraseChainReaction)、限制性片段长度多态性(restritionfragmentlengthpolymophism，RFLP)、SSCP(Single-StrandConformationPolymorphism，单链构象多态性)分析、KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR)。均针对单遗传缺陷的点突变，无法实现对众多的遗传缺陷基因实现高通量的分型鉴定。因此，建立一种高通量、快速的检测牛遗传缺陷基因的分型方法，并制定合理选种选配方案，是降低遗传缺陷带来危害的最好方法。所以，建立一种高通量的牛遗传缺陷基因筛查方法是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高通量检测牛常见遗传缺陷的引物组及试剂盒。本专利技术提供了引物组甲，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成；引物对1由引物1-HC-F和引物1-HC-R组成；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组甲，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成；引物对1由引物1‑HC‑F和引物1‑HC‑R组成；引物1‑HC‑F如序列表的序列1所示；引物1‑HC‑R如序列表的序列2所示；引物对2由引物2‑HB‑F和引物2‑HB‑R组成；引物2‑HB‑F如序列表的序列3所示；引物2‑HB‑R如序列表的序列4所示；引物对3由引物3‑HD‑F和引物3‑HD‑R组成；引物3‑HD‑F如序列表的序列5所示；引物3‑HD‑R如序列表的序列6所示；引物对4由引物4‑HM‑F和引物4‑HM‑R组成；引物4‑HM‑F如序列表的序列7所示；引物4‑HM‑R如序列表的序列8所示；引物对5由引物5‑HN‑F和引物5‑HN‑R组成；引物5‑HN‑F如序列表的序列9所示；引物5‑HN‑R如序列表的序列10所示；引物对6由引物6‑HAS‑F和引物6‑HAS‑R组成；引物6‑HAS‑F如序列表的序列11所示；引物6‑HAS‑R如序列表的序列12所示；引物对7由引物7‑HAM‑F和引物7‑HAM‑R组成；引物7‑HAM‑F如序列表的序列13所示；引物7‑HAM‑R如序列表的序列14所示；引物对8由引物8‑H1‑F和引物8‑H1‑R组成；引物8‑H1‑F如序列表的序列15所示；引物8‑H1‑R如序列表的序列16所示；引物对9由引物9‑H3‑F和引物9‑H3‑R组成；引物9‑H3‑F如序列表的序列17所示；引物9‑H3‑R如序列表的序列18所示；引物对10由引物10‑H4‑F和引物10‑H4‑R组成；引物10‑H4‑F如序列表的序列19所示；引物10‑H4‑R如序列表的序列20所示。...

【技术特征摘要】
1.引物组甲，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成；引物对1由引物1-HC-F和引物1-HC-R组成；引物1-HC-F如序列表的序列1所示；引物1-HC-R如序列表的序列2所示；引物对2由引物2-HB-F和引物2-HB-R组成；引物2-HB-F如序列表的序列3所示；引物2-HB-R如序列表的序列4所示；引物对3由引物3-HD-F和引物3-HD-R组成；引物3-HD-F如序列表的序列5所示；引物3-HD-R如序列表的序列6所示；引物对4由引物4-HM-F和引物4-HM-R组成；引物4-HM-F如序列表的序列7所示；引物4-HM-R如序列表的序列8所示；引物对5由引物5-HN-F和引物5-HN-R组成；引物5-HN-F如序列表的序列9所示；引物5-HN-R如序列表的序列10所示；引物对6由引物6-HAS-F和引物6-HAS-R组成；引物6-HAS-F如序列表的序列11所示；引物6-HAS-R如序列表的序列12所示；引物对7由引物7-HAM-F和引物7-HAM-R组成；引物7-HAM-F如序列表的序列13所示；引物7-HAM-R如序列表的序列14所示；引物对8由引物8-H1-F和引物8-H1-R组成；引物8-H1-F如序列表的序列15所示；引物8-H1-R如序列表的序列16所示；引物对9由引物9-H3-F和引物9-H3-R组成；引物9-H3-F如序列表的序列17所示；引物9-H3-R如序列表的序列18所示；引物对10由引物10-H4-F和引物10-H4-R组成；引物10-H4-F如序列表的序列19所示；引物10-H4-R如序列表的序列20所示。2.引物组乙，由扩增引物组和延伸引物组组成；所述扩增引物组为权利要求1所述引物组甲；所述延伸引物组由引物1-HC-YS-F、引物2-HB-YS-R、引物3-HD-YS-R、引物4-HM-YS-R、引物5-HN-YS-R、引物6-HAS-YS-F、引物7-HAM-YS-R、引物8-H1-YS-R、引物9-H3-YS-F和引物10-H4-YS-R组成；引物1-HC-YS-F如序列表的序列21所示；引物2-HB-YS-R如序列表的序列22所示；引物3-HD-YS-R如序列表的序列23所示；引物4-HM-YS-R如序列表的序列24所示；引物5-HN-YS-R如序列表的序列25所示；引物6-HAS-YS-F如序列表的序列26所示；引物7-HAM-YS-R如序列表的序列27所示；引物8-H1-YS-R如序列表的序列28所示；引物9-H3-YS-F如序列表的序列29所示；引物10-H4-YS-R如序列表的序列30所示。3.权利要求1所述引物组甲或权利要求2所述引物组乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定多种牛遗传缺陷；所述多种牛遗传缺陷为牛脊柱畸形综合征、牛白细胞黏附缺陷症、牛尿苷酸合成酶缺失症、牛并趾症、牛瓜氨酸血症、牛蜘蛛腿综合征、牛HH1单倍型、牛HH3单倍型和牛HH4单倍型。4.权利要求1所述引物组甲或权利要求2所述引物组乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定多种牛遗传缺陷；所述多种牛遗传缺陷为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)、(Ⅶ)、(Ⅷ)、(Ⅸ)和(Ⅹ)：(Ⅰ)SLC35A3基因第4外显子的第559位的单核苷酸突变G/T；(Ⅱ)CD18基因第2外显子的第55位的单核苷酸突变A/G；(Ⅲ)UMPS基因第5外显子的第55位的单核苷酸突变C/T；(Ⅳ)LPR4基因第33外显子的第26位的单核苷酸突变C/A；(Ⅴ)ASS基因第4外显子的第82位的单核苷酸突变C/T；(Ⅵ)SUOX基因的c.363-364insG突变；(Ⅶ)MOCS1基因的c.1224_1225delCA突变；(Ⅷ)APAF1基因第11外显子的第127位的单核苷酸突变C/T；(Ⅸ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳华，麻柱，刘林，吕小青，赵凤，
申请(专利权)人：北京奶牛中心，
类型：发明
国别省市：北京,11