用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的引物、探针、检测试剂盒以及检测方法技术

本发明专利技术涉及食品检测技术领域，具体公开一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的引物、探针、检测试剂盒以及检测方法。所述检测试剂盒包括以鸵鸟核基因CD74设计有一对引物和一条探针，检测方法至少包括如下步骤：将鸵鸟肉预处理得到鸵鸟肉样本，提取DNA，并测定DNA浓度，建立鸵鸟肉质量与DNA浓度的线性关系；将提取的DNA稀释，采用微滴式数字PCR检测鸵鸟核基因CD74拷贝数，建立DNA浓度与核基因CD74拷贝数的线性关系；根据上述步骤建立的线性关系，建立鸵鸟肉质量与核基因CD74拷贝数的线性关系。本发明专利技术具有良好的检测准确度和精密度，能较好地应用于实际检测中。

【技术实现步骤摘要】
用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的引物、探针、检测试剂盒以及检测方法
本专利技术涉及食品检测
，尤其涉及一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的引物、探针、检测试剂盒以及检测方法。
技术介绍
鸵鸟肉作为红肉的一种，具有营养价值高以及口感好等优点。与其他红肉相比，鸵鸟肉中多不饱和脂肪酸和蛋白质含量高，饱和脂肪酸和胆固醇含量低，此外，鸵鸟肉中含有较低水平的钠盐并且含有大量的铁元素以及维生素E，所以对于高血压患者以及贫血的人群来说是一种非常适合食用的肉类食材。由于这些优点，鸵鸟肉被认为是一种理想的红肉，越来越多地被追求健康生活方式的人们所接受和推崇。以养生为主打的鸵鸟肉菜以及具有降血脂降血压功效的鸵鸟肉丸等产品也逐渐走进大众的生活。然而，鸵鸟的产蛋水平相对较低，养殖成本高，并且国内人工饲养鸵鸟的规模仍然较小，所以鸵鸟肉价格比其他常见食用肉类的价格高出许多，在香港，鸵鸟肉的价格比小牛肉贵2-3倍，却仍受到食客的追捧。受到利益的驱使，一些不法商贩以廉价肉冒充鸵鸟肉进行售卖，严重损害了消费者权益，干扰了鸵鸟肉市场秩序。因此，建立一种准确定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的方法，对于遏制鸵鸟肉制品市场上制假掺假现象的发生具有重要意义。目前，对于肉制品掺假的检测鉴别方法主要包括蛋白水平的免疫分析法以及核酸水平的聚合酶链式反应(PCR)法，其中以实时荧光定量PCR(Real-timePCR)方法最为常用。Real-timePCR方法在对于鸵鸟源性成分的定性检测方面具有简便快捷的优点，然而在定量检测准确性方面则有所欠缺。
技术实现思路
针对现有无法定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的问题，本专利技术提供一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的引物和探针。以及，本专利技术还提供一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测试剂盒。以及，本专利技术还提供用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的引物和探针，所述引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物和下游引物以及探针的序列如下所示：上游引物：5'-CCTCTGCATTTGGCGACTCT-3'下游引物：5'-GGGTGGAGCCCTGCTTACA-3'探针：5'-FAM-CACAAAGTGCCTTCTCTGCCCTCTCTAAGG-Eclipse-3'。一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测试剂盒，包括上述引物和探针。具体的，优选地，所述检测试剂盒的反应体系如下：0.8μL的上游引物，0.8μL的下游引物，0.4μL的探针，10μL的不含三磷酸脱氧尿苷的ddPCRSupermixforProbes，2μL的DNA模板，6μL的ddH2O。优选地，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μM。优选地，所述探针的浓度为10μM。优选地，所述DNA模板浓度为10-100ng/μL。进一步地，本专利技术还提供一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测方法，所述检测方法至少包括以下步骤：步骤a、将鸵鸟肉预处理得到鸵鸟肉样本，提取鸵鸟肉样本中的DNA，并测定DNA浓度，建立鸵鸟肉质量与DNA浓度的线性关系；步骤b、将提取的DNA稀释，制备所述的用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测试剂盒，采用微滴式数字PCR检测鸵鸟核基因CD74拷贝数，建立DNA浓度与核基因CD74拷贝数的线性关系；步骤c、根据步骤a与步骤b建立的线性关系，建立鸵鸟肉质量与核基因CD74拷贝数的线性关系；步骤d、将待测肉粉采取与步骤a相同的预处理步骤，提取待测肉粉的DNA，通过微滴式数字PCR检测待测肉粉的CD74拷贝数，根据步骤c建立的线性关系，确定待测肉粉中鸵鸟肉源性成分。本专利技术提供的检测方法，能定量检测肉制品中鸵鸟源性成分，具有较高的准确度和灵敏度，当核酸水平低至0.625ng/μL时仍然具有良好的定量检测灵敏性，同时鸵鸟CD74基因引物探针具有良好的特异性，可以扩增出鸵鸟肉DNA样本，对于其他肉类样本均没有显著扩增。优选地，所述步骤b中微滴式数字PCR检测过程为：将检测试剂盒的反应体系充分混合离心，加入到样品孔内，然后在油孔中加入70μLDGOil，然后盖上胶垫置于微滴生成仪中生成油包水微滴，将生成的微滴全部转移至96孔PCR反应板中，封膜后进行扩增。优选地，所述步骤b中微滴式数字PCR的扩增程序为首先在95℃条件下反应5min；其次在94℃条件下反应15s，在60℃条件下反应1min，进行49次循环；然后在98℃条件下反应10min，最后在4℃条件下保持。优选地，所述步骤b中将提取的DNA稀释N倍至10-100ng/μL。优选地，所述步骤a中鸵鸟肉样本的质量分别为2.5mg、3mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg。优选地，所述步骤a中采用NanoDrop2000C超微量分光光度计测定DNA浓度。优选地，所述步骤a中，将鸵鸟肉制成肉泥，在63-67℃条件下烘干15-17h，然后研磨成粉末，过60目筛子，最后置于3-4℃密封保存得到鸵鸟肉样本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的鸵鸟肉质量与DNA浓度的线性关系图；图2是本专利技术实施例提供的DNA浓度与鸵鸟肉样本CD74基因拷贝数线性关系图；图3是本专利技术实验例提供的Real-timePCR验证鸵鸟CD74基因引物探针特异性图；图4是本专利技术实验例提供的数字PCR方法验证鸵鸟CD74基因引物探针特异性图；图5是本专利技术实验例提供的数字PCR方法检测牛GH和猪PRNP基因引物探针灵敏性图。其中：图4中A05：鸵鸟，D05：鸡，E05：鸭，F05：鹅，G05：鸽子，H05：鹌鹑，B06：袋鼠，C06：火鸡，D06：绵羊，E06：山羊，F06：牛，G06：猪，H06：马，A07：驴，B07：猫，C07：狗，D07：兔，E07：貉子，F07：貂，G0：狐狸，H07：空白对照；图5中A10：100ng/μL，B10：50ng/μL，C10：25ng/μL，D10：12.5ng/μL，E10：6.25ng/μL，F10：3.125ng/μL，G10：1.5625ng/μL，H10：0.625ng/μL。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。为了更好的说明本专利技术实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。实施例1本专利技术实施例提供一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：步骤a、将鸵鸟肉预处理得到鸵鸟肉样本，提取鸵鸟肉样本中的DNA，采用NanoDrop2000C超微量分光光度计测定DNA浓度，以鸵鸟肉质量X1(mg)为横坐标，以DNA浓度的平均值Y1(ng/μL)为纵坐标，建立标准曲线，得到鸵鸟肉质量-DNA浓度的线性关系式，计算每个质量鸵鸟肉样本DNA浓度的3个平行间的相对标准偏差(relatives本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的引物和探针，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物和下游引物以及探针的序列如下所示：上游引物：5'‑CCTCTGCATTTGGCGACTCT‑3'下游引物：5'‑GGGTGGAGCCCTGCTTACA‑3'探针：5'‑FAM‑CACAAAGTGCCTTCTCTGCCCTCTCTAAGG‑Eclipse‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的引物和探针，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物和下游引物以及探针的序列如下所示：上游引物：5'-CCTCTGCATTTGGCGACTCT-3'下游引物：5'-GGGTGGAGCCCTGCTTACA-3'探针：5'-FAM-CACAAAGTGCCTTCTCTGCCCTCTCTAAGG-Eclipse-3'。2.一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物和探针。3.如权利要求2所述的用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒的反应体系如下：0.8μL的上游引物，0.8μL的下游引物，0.4μL的探针，10μL的不含三磷酸脱氧尿苷的ddPCRSupermixforProbes，2μL的DNA模板，6μL的ddH2O。4.如权利要求3所述的用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测试剂盒，其特征在于：所述上游引物和下游引物的浓度均为10μM；和/或所述探针的浓度为10μM；和/或所述DNA模板浓度为10-100ng/μL。5.一种用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测方法，其特征在于：所述检测方法至少包括以下步骤：步骤a、将鸵鸟肉预处理得到鸵鸟肉样本，提取鸵鸟肉样本中的DNA，并测定DNA浓度，建立鸵鸟肉质量与DNA浓度的线性关系；步骤b、将提取的DNA稀释，利用如权利要求2-4任一项所述的用于定量检测肉制品中鸵鸟源性成分的检测试剂盒，采用微滴式数字PCR检测鸵鸟核基因CD74拷贝数，建立DNA浓度与核基因CD74拷贝数的线性关系；步骤c、根据步骤a与步骤b建立的线性关系，建...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建昌，刘立兵，郭春海，石蕊寒，孙晓霞，
申请(专利权)人：河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：河北,13