与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供与绵羊产羔相关的SNP分子标记及其应用，该分子标记位于绵羊第15号染色体第856850位(NW_014639024.1)，是Juno基因SNP标记。本发明专利技术提供了用于检测该SNP标记的特异性引物组合，特异性引物组合的序列如SEQ ID NO.1‑3所示，基于Sequenom

【技术实现步骤摘要】
与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及与中国山羊产奶性状相关的SNP分子标记、以及检测中国山羊产奶性状的方法。
技术介绍
单核苷酸多态性标记(SNP)主要是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧核苷酸的变异所引起的DNA片段的多态性。SNP的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现的形式有替换、插入和缺失等。SNP的检测方法，目前常用的包括，sanger测序、DNA芯片、飞行时间质谱、以及最新的高通量二代测序等技术。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型是近些年兴起的一种方法。SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。产羔数性状是绵羊最重要的经济性状之一，因其受微效多基因控制且遗传力低，难以用常规育种方法来快速改良，而分子技术能有效快速地提高其遗传进展，因此鉴定与产羔数相关的主效基因或分子遗传标记是现代分子育种的关键。人类叶酸受体((FolateReceptor，FR)是一个蛋白家族，共有4种亚型：α、β、γ、δ。其中α、β亚型是由GPI锚定的膜蛋白，在肿瘤靶向研究中表现活跃；γ是淋巴细胞分泌蛋白；叶酸受体4(folatereceptor4，Folr4，即Folrδ)是在卵子表面表达的GPI锚定蛋白，同样在抗肿瘤治疗中被检测到。同时FOLR4也调节饲喂叶酸后小鼠的生理反应。2014年Bianchi等发现Folr4蛋白是哺乳动物卵子上的受体，该受体与精子顶体膜上IZUMO1蛋白特异性结合，促进精卵识别并完成受精。但是之前未报道卵子中FOLR4有此功能，Bianchi等发现Folr4虽然序列和叶酸受体家族相似，但重组的FOLR4蛋白并不能像FOLR1和FOLR2一样结合叶酸，这可能是由于它结合叶酸的关键氨基酸区域的结构不同。此后Bianchi等将其命名为Juno。人的Juno基因定位于11号染色体，小鼠定位于9号染色体，绵羊定位于15号染色体，牛定位于15号染色体。Bianchi等发现IZUMO1和JUNO的相互作用在几种哺乳动物中都是保守的，比如人、小鼠、猪、负鼠。在小鼠上的研究表明JUNO缺陷的卵子由于不能够和正常的精子融合会导致母鼠不育，精子蛋白IZUMO1和卵子的受体JUNO的识别结合实际上是一种粘附作用，这种粘附作用在人和小鼠的卵子中都是保守的。研究表明，卵子表面的JUNO蛋白在粘附作用后的40min之内会逐渐从卵膜上脱落，进入囊泡并释放到卵膜外，并与其它发生顶体反应的精子结合将其快速中和掉，这一脱落机制与防止多精子进入卵细胞有重要关系，保证了卵子在自然情况下只能和一个精子融合。正是由于JUNO的这种关键作用，JUNO的敏感性很可能会影响哺乳动物的受孕率和精卵识别效率进而影响哺乳动物的繁殖力，比如产羔数性状等。迄今为止，对Juno的研究主要集中在人类和小鼠上，对于绵羊繁殖领域的研究较少见于报道，特别是有关绵羊Juno基因的克隆、表达和功能研究均未见报道。本研究利用PCR结合RACE技术从小尾寒羊卵巢中克隆Juno基因的cDNA全长序列并对其进行了生物信息学分析，同时采用RT-PCR、RT-qPCR技术检测该基因在各组织的表达情况，以期为进一步揭示小尾寒羊Juno基因的功能和表达调控提供依据，同时为深入研究绵羊多羔调控的分子机制提供基础依据。目前关于Juno基因在绵羊繁殖过程中的具体作用研究几乎没有，对其进行研究有助于挖掘出更多与绵羊产羔数相关的分析标记。传统的基因型检测方法，大多采用PCR-RFLP(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism)和PCR-SSCP(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism)检测方法，这些方法通量较低，程序繁多，较难实现高通量自动化测定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用，并提供了一种利用SequenomSNP技术检测绵羊Juno基因型的方法。本专利技术的技术方案为：本申请通过对10个绵羊品种99个绵羊个体进行全基因组重测序并将其分为单羔组和多羔组。在99个绵羊的重测序结果中通过Fst值计算获得了大量的有效SNP位点并筛选获得一些基因，其中包括Juno基因。然后在5个绵羊品种中做了基因分型，并且在380只小尾寒羊中做了产羔数的关联分析，发现与产羔数相关。进一步克隆了这个基因，并做了组织表达谱和表达量的分析，并做了生物信息学分析。本专利技术首先提供一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记，其含有一个与绵羊多羔相关的SNP位点，该位点位于绵羊第15号染色体856850bp位点(NW_014639024.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年11月)，该位点的碱基存在C/A突变，与绵羊多羔具有显著的相关性。基于此，本专利技术提供一种检测绵羊多羔候选基因Juno基因型的方法，通过对绵羊第15号染色体856850bp位点(NW_014639024.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年11月)的核苷酸进行单核苷酸型检测，根据检测结果判定绵羊Juno基因为AA、CA或CC。本专利技术利用SequenomSNP技术实现单核苷酸型检测。本专利技术提供用于检测上述SNP分子标记或绵羊Juno基因型的特异性引物组合：PCR扩增引物的核苷酸序列如下：上游引物F：5’-ACGTTGGATGTCTCAGGAGAGGAGAGGCAG-3’；下游引物R：5’-ACGTTGGATGTCTGCAGAAGTGGTTCGAGC-3’；延伸引物的核苷酸序列如下：S1：5’-TGGCCCGCCGCTT-3’。本专利技术提供含有上述特异性引物组合的用于SequenomSNP技术检测绵羊Juno基因型的试剂盒。进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板和SAP酶。本专利技术提供了所述SNP分子标记或所述的特异性引物组合或所述的试剂盒在绵羊分子辅助育种中的应用。本专利技术提供了所述SNP分子标记或所述的特异性引物组合或所述的试剂盒在鉴定绵羊多羔性状中的应用。本专利技术提供的利用SequenomSNP技术检测绵羊Juno基因型的方法，包括以下步骤：1)提取待测绵羊的基因组DNA；2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上游引物F和下游引物R，进行PCR扩增反应；所述上游引物F：5’-ACGTTGGATGTCTCAGGAGAGGAGAGGCAG-3’；下游引物R：5’-ACGTTGGATGTCTGCAGAAGTGGTTCGAGC-3’；3)用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；4)以消化后的PCR扩增产物为模板，利用延伸引物进行延伸反应；所述延伸引物为5’-TGGCCCGCCGCTT-3’；5)分析延伸产物，从而对绵羊Juno基因型进行判定。其中，步骤2)中PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计为：20-50ng/μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记，其特征在于，位于绵羊第15号染色体第856850bp处，该SNP分子标记的多态性为A/C。

【技术特征摘要】
1.一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记，其特征在于，位于绵羊第15号染色体第856850bp处，该SNP分子标记的多态性为A/C。2.用于检测权利要求1所述SNP分子标记的特异性引物组合，其特征在于，包括：上游引物F：5’-ACGTTGGATGTCTCAGGAGAGGAGAGGCAG-3’；下游引物R：5’-ACGTTGGATGTCTGCAGAAGTGGTTCGAGC-3’；延伸引物的核苷酸序列如下：S1：5’-TGGCCCGCCGCTT-3’。3.基于SequenomSNP技术用于检测绵羊Juno基因型的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性引物组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板和SAP酶。5.权利要求1所述SNP分子标记或权利要求2所述的特异性引物组合或权利要求3所述的试剂盒在绵羊分子辅助育种中的应用。6.权利要求1所述SNP分子标记或权利要求2所述的特异性引物组合或权利要求3所述的试剂盒在鉴定绵羊多羔性状中的应用。7.利用SequenomSNP技术检测绵羊Juno基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测绵羊的基因组DNA；2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上游引物F和下游引物R，进行PCR扩增反应；所述上游引物F：5’-ACGTTGGATGTCTCAGGAGAGGAGAGGCAG-3’；下游引物R：5’-ACGTTGGATGTCTGCAGAAGTGGTTCGAGC-3’；3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡文萍，储明星，董新龙，田志龙，汤继顺，刘秋月，狄冉，王翔宇，梁奔梦，郭晓飞，魏彩虹，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11