一种生物酶法转化生产β-丙氨酸和D-天冬氨酸的方法技术

本发明专利技术属于酶催化技术领域，特别涉及一种生物酶法转化生产β‑丙氨酸和D‑天冬氨酸的方法。针对现有的生物酶法合成β‑丙氨酸和D‑天冬氨酸的方法要么产率过低，要么在生物转化过程中必须不间断地人工添加固体底物，皆不适宜于工业化的问题，本发明专利技术的技术方案是：包括如下步骤：[1]进行高密度发酵获得过表达L‑天冬氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌；[2]利用大肠杆菌工程菌以DL‑天冬氨酸为底物进行生物转化，在转化过程中流加DL‑天冬氨酸钠溶液进行补加底物，同时通过流加DL‑天冬氨酸盐酸盐溶液控制转化体系pH，获得β‑丙氨酸和D‑天冬氨酸。将底物替换为L‑天冬氨酸能够单独合成得到β‑丙氨酸。本发明专利技术适用于β‑丙氨酸和D‑天冬氨酸的合成。

【技术实现步骤摘要】
一种生物酶法转化生产β-丙氨酸和D-天冬氨酸的方法
本专利技术属于酶催化
，特别涉及一种生物酶法转化生产β-丙氨酸和D-天冬氨酸的方法。
技术介绍
β-丙氨酸，又名β-型氨基丙酸，是自然界唯一存在的一种β型氨基酸，主要应用于食品、医药和化工等领域。在食品方面主要应用于食品添加剂；在医药方面主要应用于合成抑制肿瘤骨转移的帕米磷酸钠和抗结肠药物巴柳氮；在化工方面主要用于合成泛酸钙和肌肽等。D-天冬氨酸是一种重要的手性化合物，主要要用药物前体及中间体的合成，比如N-甲基-D-天冬氨酸钠、阿扑西林和D-天冬氨酸-β-羟胺等；还可参与合成一些抗生素(如β-内酰胺抗生素)的侧链来提高抗生素的活性。在食品工业中，可作为新型食品添加剂和防腐剂的合成原料。目前β-丙氨酸和D-天冬氨酸的合成方法主要有化学合成法和生物酶法合成。(1)化学合成β-丙氨酸的方法在国内主要以丙烯腈法为主，是将丙烯腈和氨水通过氨化反应生成β-氨基丙腈，然后在碱性或者酸性条件下水解获得β-丙氨酸。此法原料便宜，成本低，但伴随有副反应，并且在水解过程中会生成大量的无机盐，后处理成本高。而D-天冬氨酸主要以化学不对称拆分为主，工业复杂，产物光学纯度低。(2)生物酶法合成由于反应条件温和，底物专一性强及环境友好等特点受到较高的关注。专利NO.CN101210230A公开用过表达酶源于大肠杆菌自身的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的工程菌进行生物合成β-丙氨酸，产量为2.94g/L，产量低，无法进行工业化生产。专利CN1.3898035B公开一种生产β-丙氨酸的方法，通过构建含有来源于谷氨酸棒状杆菌的天冬氨酸-1-脱羧酶的重组大肠杆菌菌株且缺失了天冬氨酸氨基裂解酶基因，使得底物全部用于合成β-丙氨酸，底物转化率达90％以上，但在生物转化的过程中，其底物是以固体的形式添加来控制转化体系的pH，意味着在大生产过程中不断地进行投加底物，增加了工人的劳动强度且不能精确控制pH。酶法生产D-天冬氨酸有不对称降解法(昭56-20753)，其利用假丝酵母以DL-天冬氨酸为底物通过降解掉L-天冬氨酸来获得D-天冬氨酸；专利CN102443612A用L-天冬氨酸-β-脱羧酶以DL-天冬氨酸为底物进行生产D-天冬氨酸和丙氨酸。同样在转化过程中用DL-天冬氨酸来控制pH，操作繁重(不间断)且不能精确控制pH。综上所述，现有的生物酶法合成β-丙氨酸和D-天冬氨酸的方法要么产率过低，要么在生物转化过程中必须不间断地人工添加固体底物，皆不适宜于工业化。
技术实现思路
针对现有的生物酶法合成β-丙氨酸和D-天冬氨酸的方法要么产率过低，要么在生物转化过程中必须不间断地人工添加固体底物，皆不适宜于工业化的问题，本专利技术提供一种生物酶法转化生产β-丙氨酸和D-天冬氨酸的方法，其目的在于：在转化过程中底物实现自动补加且pH可以自动精确控制，保证了酶的最适pH条件，节约了大量人力，有利于实现生物法合成β-丙氨酸和D-天冬氨酸的工业化生产。本专利技术采用的技术方案如下：一种生物酶法转化生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：[1]构建过表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的重组大肠杆菌，并进行高密度发酵获得过表达L-天冬氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌；[2]利用步骤[1]得到的大肠杆菌工程菌以L-天冬氨酸为底物进行生物转化，在转化过程中流加L-天冬氨酸钠溶液进行补加底物，并用L-天冬氨酸盐酸盐溶液控制转化体系pH为6.0-7.0，获得β-丙氨酸。采用该技术方案后，在转化过程中底物以液体溶液形式按一定的流加速率进行补加，操作方便，pH可以实现精确控制，维持反应体系在最适pH，保证了L-天冬氨酸-α-羧化酶活性，与目前已报道工艺中以底物固体形式补加底物的相比，大大节约了人力成本，有利于实现生物法合成β-丙氨酸的工业化生产。优选的，步骤[1]中构建过表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的重组大肠杆菌的方法包括如下步骤：[1-1]对枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因序列进行基因密码子优化，全基因合成两端携带NdeI和XhoI限制性内切酶位点的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因序列，将合成的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因序列克隆于pUC57载体上，获得pUC57-PanD质粒；[1-2]用NdeI和XhoI双酶切步骤[1-1]得到的pUC57-panD质粒和表达载体pET32a(+)质粒，接着用T4连接酶将酶切产物pET32a(+)和panD片段进行连接，连接产物转化入克隆菌株DH5α，筛选获得阳性重组子，抽提菌液获得重组质粒pET32a-panD；[1-3]通过热激法将步骤[1-2]得到的重组质粒pET32a-panD转入大肠杆菌Rosetta中，筛选阳性重组子即获得用于生产β-丙氨酸和D-天冬氨酸的重组大肠杆菌。已知现有β-丙氨酸生物合成转化工艺都需要添辅酶PLP(5-磷酸吡哆醛)后酶法催化反应才能进行，即L-天冬氨酸-α-脱羧酶为PLP依赖型。本优选方案开发的用于生产β-丙氨酸和D-天冬氨酸的重组大肠杆菌在生物转化时无需添加辅酶PLP就可以获得高产量的β-丙氨酸，大大降低了发酵成本。优选的,步骤[1]中进行高密度发酵获得过表达L-天冬氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌的方法包括如下步骤：[1-4]在无菌条件下，按0.1％～1％的接种量将过表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的重组大肠杆菌移种至一级种子培养基中，在温度37℃，转速220rpm的条件下培养至OD600为3.0～4.0，停止培养得到一级种子菌液；[1-5]将步骤[1-4]得到的一级种子菌液按4％～10％接种量转接二级种子培养基中，在温度37℃，转速220rpm的条件下培养3～5h，得到二级种子菌液；[1-6]按1％～8％的接种量将步骤[1-5]得到的二级种子菌液通过火焰接种转接入发酵罐中，设置初始发酵参数为：温度37℃，转速200rpm，pH＝7.0，通气量50L/h,罐压0.05MPa；随着菌浓度逐渐增加通过调节转速和通气量将溶氧控制在20％～40％；直到溶氧和pH值同时快速升高时，开始流加补料；直到OD600达到20～25时，先将温度降至28℃，添加诱导剂，继续发酵12h～15h后放罐；低温离心收集菌体并冷藏待用。优选的，步骤[2]的具体过程为：设置起始反应体系为0.4体积，使反应体系含有0.2mol/LL-天冬氨酸和0.1mol/L无水碳酸钠，5％菌体，pH6.5；转化条件为温度37℃，转速200rpm，转化过程中用0.3体积的L-天冬氨酸盐酸盐溶液调节pH＝6.0-7.0；转化2h后，以60mL～200mL/h的流速流加0.3体积的L-天冬氨酸钠溶液转化14h～36h时停止反应。采用该技术方案后，步骤[2]的生物转化过程中使用的菌体可回收进行二次利用，有利于节约成本。本专利技术还提供一种生物酶法转化生产β-丙氨酸和D-天冬氨酸的方法，包括如下步骤：[1]进行高密度发酵获得过表达L-天冬氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌；[2]利用步骤[1]得到的大肠杆菌工程菌以DL-天冬氨酸为底物进行生物转化，在转化过程中流加DL-天冬氨酸钠溶液进行补加底物，同时通过流加DL-天冬氨酸盐酸盐溶液控制转化体系pH为6.0-7.0，获得β-丙氨酸和D-天冬氨酸的混合物，分离后分别得到β-丙氨酸和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物酶法转化生产β‑丙氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：[1]构建过表达L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的重组大肠杆菌，并进行高密度发酵获得过表达L‑天冬氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌；[2]利用步骤[1]得到的大肠杆菌工程菌以L‑天冬氨酸为底物进行生物转化，在转化过程中流加L‑天冬氨酸钠溶液进行补加底物，并用L‑天冬氨酸盐酸盐溶液控制转化体系pH为6.0‑7.0，获得β‑丙氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种生物酶法转化生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：[1]构建过表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的重组大肠杆菌，并进行高密度发酵获得过表达L-天冬氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌；[2]利用步骤[1]得到的大肠杆菌工程菌以L-天冬氨酸为底物进行生物转化，在转化过程中流加L-天冬氨酸钠溶液进行补加底物，并用L-天冬氨酸盐酸盐溶液控制转化体系pH为6.0-7.0，获得β-丙氨酸。2.按照权利要求1所述的一种生物酶法转化生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤[1]中构建过表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的重组大肠杆菌具体包括如下步骤：[1-1]对枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因序列进行基因密码子优化，全基因合成两端携带NdeI和XhoI限制性内切酶位点的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因序列，将合成的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因序列克隆于pUC57载体上，获得pUC57-PanD质粒；[1-2]用NdeI和XhoI双酶切步骤[1-1]得到的pUC57-panD质粒和表达载体pET32a(+)质粒，接着用T4连接酶将酶切产物pET32a(+)和panD片段进行连接，连接产物转化入克隆菌株DH5α，筛选获得阳性重组子，抽提菌液获得重组质粒pET32a-panD；[1-3]通过热激法将步骤[1-2]得到的重组质粒pET32a-panD转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，筛选阳性重组子即获得用于生产β-丙氨酸和D-天冬氨酸的重组大肠杆菌。3.按照权利要求1或2所述的一种生物酶法转化生产β-丙氨酸的方法，其特征在于,步骤[1]中进行高密度发酵获得过表达L-天冬氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌具体包括如下步骤：[1-4]在无菌条件下，按0.1％～1％的接种量将过表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的重组大肠杆菌移种至一级种子培养基中，在温度37℃，转速220rpm的条件下培养至OD600为3.0～4.0，停止培养得到一级种子菌液；[1-5]将步骤[1-4]得到的一级种子菌液按4％～10％接种量转接二级种子培养基中，在温度37℃，转速220rpm的条件下培养3～5h，得到二级种子菌液；[1-6]按1％～8％的接种量将步骤[1-5]得到的二级种子菌液通过火焰接种转接入发酵罐中，设置初始发酵参数为：温度37℃，转速200rpm，pH＝7.0，通气量50L/h,罐压0.05MPa；随着菌浓度逐渐增加通过调节转速和通气量将溶氧控制在20％～40％；直到溶氧和pH值同时快速升高时，开始流加补料；直到OD600达到20～25时，先将温度降至28℃，添加诱导剂，继续发酵12h～15h后放罐；低温离心收集菌体并冷藏待用。4.按照权利要求1所述的一种生物酶法转化生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤[2]的具体过程为：设置起始反应体系为0.4体积，使反应体系含有0.2mol/LL-天冬氨酸和0.1mol/L无水碳酸钠，5％菌体，pH＝6.5；转化条件为温度37℃，转速200rpm，转化过程中用0.3体积的L-天冬氨酸盐酸盐溶液调节pH＝6.5；转化2h后，以60mL～200mL/h的流速流加0.3体积的L-天冬氨酸钠溶液转化14h～36h时停止反应。5.一种生物酶法转化生产β-丙氨酸和D-天...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晚军，王苓，刘超，曾帅，刘鑫，杨顺楷，陈纹锐，
申请(专利权)人：四川同晟生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51