农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法技术

本发明专利技术涉及小麦光腥黑粉菌的遗传转化，具体涉及农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法。包括：培养TFL冬孢子，当萌发率≥60％时收集菌丝，配制1×10

【技术实现步骤摘要】
农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法
本专利技术涉及小麦光腥黑粉菌的遗传转化，具体涉及农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法。
技术介绍
小麦光腥黑粉菌(Tilletiafoetida(Wallr.)Liro,TFL)引起的小麦光腥黑穗病是世界上最具破坏性的小麦病害之一，在我国北方麦区发生较多，是北京市补充农业植物检疫性有害生物。光腥黑粉菌通过产生有毒的黑色真菌冬孢子释放鱼腥味的三甲胺，引起小麦减产和品质降低，给小麦生产造成毁灭性的危害。此病菌孢子含量超过0.6％即可引起严重中毒现象，人畜食后重者可引起恶心、呕吐甚至昏迷等中毒症状(Goats,1999；Hoffman,1982)。因此，对小麦光腥黑穗病的防治刻不容缓。有关小麦光腥黑粉菌的致病基因及致病分子机理尚不清楚，而构建大容量的小麦光腥黑粉菌转化子库是研究该病菌功能基因及小麦-光腥黑粉菌互作的基础。在众多真菌遗传转化方法中，农杆菌介导的转化技术(ATMT)不仅具有操作简便、转化效率高、受体不受限制等优点，而且转化子稳定性好、T-DNA在真菌基因组中多为单拷贝插入，该技术已在多种真菌的遗传转化中得到广泛应用。然而，由根癌农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌的遗传转化非常困难，目前还未见到根癌农杆菌介导小麦光腥黑粉菌的遗传转化体系的相关报道。
技术实现思路
为了促进小麦光腥黑粉菌致病分子机制的研究，本专利技术提供一种农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法，该方法能够将外源基因成功转入小麦光腥黑粉菌基因组中并稳定遗传。本专利技术请求保护的技术方案如下：农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌丝液制备：培养小麦光腥黑粉菌冬孢子，当冬孢子萌发率≥60％时收集菌丝，离心去上清液，然后用灭菌水配制浓度为1×106个/ml的菌丝液；(2)农杆菌菌液制备：将含有表达载体的农杆菌接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养2-3d，用IM培养基稀释菌液至OD600为0.5，继续振荡培养7-8h，然后用IM培养基稀释菌液至OD600为0.45-0.5；(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸，将OD600为0.45-0.5的农杆菌菌液与1×106个/ml的菌丝液等体积混合并加入乙酰丁香酮至终浓度为200μmol/l，然后涂布于玻璃纸上，置于22℃下黑暗培养24h；然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，16℃培养至菌落长出。优选地，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。优选地，培养小麦光腥黑粉菌冬孢子的步骤如下：配制浓度为(100-105)×104个/mL的冬孢子悬浮液，取冬孢子悬浮液涂布于水琼脂培养基上，置于16℃，相对湿度为80％的人工气候生长培养箱中全光照培养。优选地，所述水琼脂培养基的配方为：称取20g琼脂粉，加水定容到1L。优选地，所述CM固体培养基的配方为：酵母膏1g，酶水解干酪素0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖10g，Ca(NO3)2·4H2O1g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.25g，NaCl0.15g，琼脂18g，加蒸馏水至1000mL。优选地，所述IM培养基的配方为：K-buffer0.8mL，M-Nbuffer20mL，1％CaCl2·2H2O(w/v)1mL，20％葡萄糖(w/v)10mL，20％NH4NO3(w/v)2.5mL，50％甘油(v/v)10mL，补蒸馏水至1000mL；所述K-buffer的配方为：200g/LK2HPO4，145g/LKH2PO4；所述M-Nbuffer的配方为：30g/LMgSO4·7H2O，15g/LNaCl。优选地，所述IM培养基在使用之前，每毫升IM培养基加入4μL0.2mol/L乙酰丁香酮，1μL0.01％FeSO4(w/v)，10μL100mg/mL2-(N-吗啡啉)乙磺酸。优选地，所述表达载体为pDHT-sk。优选地，所述LB液体培养基含有100μg/mL的利福平和50μg/mL的卡那霉素。优选地，所述CM固体培养基含有100μg/mL的潮霉素B和200μg/mL的头孢噻肟钠。由农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化十分困难，至今仍未见成功转化的报道。影响小麦光腥黑粉菌转化的因素很多，包括冬孢子萌发菌丝的活力和浓度、农杆菌的活力和浓度、菌丝和农杆菌的配比、IM培养基组成、CM培养基组成、共培养温度，任何条件的改变都可能导致转化失败。专利技术人经过长期研究，首次建立了农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化体系，利用根癌农杆菌菌株EHA105成功转化了小麦光腥黑粉菌，并获得了85个/106的转化率，为研究小麦光腥黑粉菌致病分子机制奠定了基础。附图说明图1.在CM平板上长出的小麦光腥黑粉菌转化子。图2.转化子鉴定结果；其中，泳道1：含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105的菌液PCR产物；泳道2-5：TFL转化子菌落PCR产物；泳道6：以ddH2O为模板的PCR产物。图3.转化子的假阳性鉴定结果；其中，泳道1：含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105的菌液PCR产物；泳道2-5：TFL转化子菌落PCR产物；泳道6：以ddH2O为模板的PCR产物。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不限制本专利技术的保护范围。生物材料小麦光腥黑粉菌(Tilletiafoetida(Wallr.)Liro,TFL)：本专利技术所使用的小麦光腥黑粉菌为现有文献《小麦光腥黑穗菌萌发的超微结构研究》，西北农业大学学报，1999，03期(3)：110-112所记载的菌株。本专利技术所使用的农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。主要试剂与仪器2％水琼脂培养基的制备方法：称取20g琼脂粉，加水定容到1L，121℃高压蒸汽灭菌。IM培养基(InductionMedium，诱导培养基)：K-buffer(pH4.9)0.8mL，M-Nbuffer20mL，1％CaCl2·2H2O(w/v)1mL，20％葡萄糖(w/v)10mL，20％NH4NO3(w/v)2.5mL，50％甘油(v/v)10mL，补蒸馏水至1000mL，分装后121℃高压蒸汽灭菌30min。在使用培养基之前，每毫升加4μL0.2mol/LAS(乙酰丁香酮)，1μL0.01％FeSO4(w/v)，10μL100mg/mL2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)。其中，w/v均表示g/ml。K-buffer配方：以ddH2O为溶剂，含200g/LK2HPO4，145g/LKH2PO4。M-Nbuffer配方：以ddH2O为溶剂，含30g/LMgSO4·7H2O，15g/LNaCl。CM培养基(CompleteMedium，完全培养基)：酵母膏1g，酶水解干酪素0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖10g，Ca(NO3)2·4H2O1g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.25g，NaCl0.15g，琼脂18g，加蒸馏水至1000mL，分装后121℃高压蒸汽灭菌30min。用于小麦光腥黑粉菌-农杆菌的黑暗共培养。YEB培养基：胰蛋白胨5g，酵母提取物1g，牛肉浸膏5g，MgSO40.5g，蔗糖5g，用NaOH调本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌丝液制备：培养小麦光腥黑粉菌冬孢子，当冬孢子萌发率≥60％时收集菌丝，离心去上清液，然后用灭菌水配制浓度为1×106个/ml的菌丝液；(2)农杆菌菌液制备：将含有表达载体的农杆菌接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养2‑3d，用IM培养基稀释菌液至OD600为0.5，继续振荡培养7‑8h，然后用IM培养基稀释菌液至OD600为0.45‑0.5；(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸，将OD600为0.45‑0.5的农杆菌菌液与1×106个/ml的菌丝液等体积混合并加入乙酰丁香酮至终浓度为200μmol/l，然后涂布于玻璃纸上，置于22℃下黑暗培养24h；然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，16℃培养至菌落长出。

【技术特征摘要】
2017.10.31 CN 20171104028131.农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌丝液制备：培养小麦光腥黑粉菌冬孢子，当冬孢子萌发率≥60％时收集菌丝，离心去上清液，然后用灭菌水配制浓度为1×106个/ml的菌丝液；(2)农杆菌菌液制备：将含有表达载体的农杆菌接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养2-3d，用IM培养基稀释菌液至OD600为0.5，继续振荡培养7-8h，然后用IM培养基稀释菌液至OD600为0.45-0.5；(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸，将OD600为0.45-0.5的农杆菌菌液与1×106个/ml的菌丝液等体积混合并加入乙酰丁香酮至终浓度为200μmol/l，然后涂布于玻璃纸上，置于22℃下黑暗培养24h；然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，16℃培养至菌落长出。2.根据权利要求1所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。3.根据权利要求1所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，培养小麦光腥黑粉菌冬孢子的步骤如下：配制浓度为(100-105)×104个/mL的冬孢子悬浮液，取冬孢子悬浮液涂布于水琼脂培养基上，置于16℃，相对湿度为80％的人工气候生长培养箱中全光照培养。4.根据权利要求3所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述水琼脂培养基的配方为：称取20g琼脂粉，加水定容到1L。5.根据权利要求1所述的小麦光腥...

【专利技术属性】
技术研发人员：高利，陈万权，秦丹丹，陈德来，魏晓庆，刘俭俭，刘太国，刘博，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11