一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，包括以下步骤：(1)构建HPH‑GFP融合表达载体，并克隆出HPH‑GFP片段；(2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因的上、下游片段；(3)克隆待敲除基因上、下游片段与HPH‑GFP组成嵌合体片段；(4)用嵌合体片段转化真菌原生质体，得转化子备用；(5)将转化子置于含有潮霉素的培养基中进行培养，对正常生长出来的菌丝，用荧光显微镜观察并选择有GFP荧光的转化子，即为敲除突变体；本发明专利技术用以解决现有技术存在的基因敲除筛选成功率低，假阳性率高等技术问题。

Screening method for filamentous fungus gene knockout mutant

The invention discloses a screening method for filamentous fungi gene knockout mutants, which comprises the following steps: (1) constructing HPH_GFP fusion expression vector and cloning HPH_GFP fragment; (2) cloning the upstream and downstream fragments of the gene to be knocked out with primers with junction sequences; (3) cloning the upstream and downstream fragments of the gene to be knocked out and the HPH_GFP fragment, respectively. _GFP is composed of chimeric fragments; (4) fungal protoplasts are transformed with chimeric fragments and transformants are prepared; (5) the transformants are cultured in a medium containing hygromycin, and the normally grown hyphae are observed by fluorescence microscope and selected as knockout mutants; the invention is used for To solve the technical problems of low success rate and high false positive rate of gene knockout in the existing technology.

【技术实现步骤摘要】
一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法
本专利技术涉及一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，属于基因工程领域。
技术介绍
真菌在自然界广泛分布，与人类生活的各个方面都有这密不可分的联系。因此对真菌的研究变得尤为重要，其中对真菌的基因功能进行研究是研究的热点之一。通过对真菌DNA进行遗传改造是基因功能研究的重要技术，目前，对丝状真菌进行遗传改造的方法主要有：(1)PEG介导的原生质体转化；(2)农杆菌介导的转化(A.tumeafeiensmediatedtransformation,ATMT)；(3)电击转化；(4)基因枪转化；等方法。基因敲除是研究基因功能的手段之一，利用同源重组原理对感兴趣的基因进行敲除，通过观察敲除突变体的表型变化从而明确该基因的功能，最终实现改良或防治真菌的目的。目前，常用的基因敲除的方法有：(1)同源重组基因敲除，即利用基因两侧的同源臂在位点特异性DNA重组酶的作用下进行基因敲除是最流行的方法；(2)基因沉默(RNAsilence)诱导的基因敲除，通过构建小的双链RNA片段干扰基因的表达，并且这种干扰效应会持续“传递”到子代细胞，从而造成基因敲除；(3)转座子和逆转录转座子标签法，转座子在基因组中会发生“跳跃”，从而能造成染色体的畸变或基因的缺失。以上的基因敲除方法最终都需要筛选标记对敲除突变体进行筛选，丝状真菌基因敲除时常用的筛选标记有潮霉素、新霉素和G418等，筛选成功率不到30％，存在着筛选效率低，假阳性率高等缺点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，以解决现有技术存在的基因敲除筛选成功率低，假阳性率高等技术问题。本专利技术的技术方案是：一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，包括以下步骤：(1)构建HPH-GFP融合表达载体，并克隆出HPH-GFP片段；(2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因的上、下游片段；(3)克隆待敲除基因上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段；(4)用嵌合体片段转化真菌原生质体，得转化子备用；(5)将转化子置于含有潮霉素的培养基中进行培养，对正常生长出来的菌丝，用荧光显微镜观察并选择有GFP荧光的转化子，即为敲除突变体。前述构建HPH-GFP融合表达载体的方法是：分别克隆潮霉素基因HPH和GFP基因，获得潮霉素HPH片段和GFP片段，再用PCR将HPH和GFP基因融合到表达载体，克隆得到HPH-GFP片段，即HPH-GFP融合表达载体。在步骤(3)中，以步骤(1)得到的HPH-GFP片段和步骤(2)得到的待敲除基因上下游片段为模板，扩增得到两个上下游片段-HPH-GFP的片段，1：1混合两个片段，得嵌合体片段备用。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用同源重组的原理，采用两步法PCR进行基因敲除，并利用潮霉素和绿色荧光蛋白(GFP)同时进行转化子的筛选，大大提高了筛选效率。据申请人试验，经过潮霉素和GFP双重筛选，可将真菌转化子筛选效率从现有的20％提高到50％以上，这极大的减少了工作量，同时在其他真菌中也可借鉴此方法进行基因敲除。附图说明图1是MoNACα转化子在潮霉素培养基上的生长情况；图2是有GFP荧光的MoNACα阳性转化子；图3是PCR检验MoNACα转化子的图。具体实施方式下面结合附图及具体的实施例对专利技术进行进一步介绍：以稻瘟菌NACα基因的敲除及筛选为例：从稻瘟菌数据库(http://fungidb.org/fungidb/)中搜索NAC基因，发现一个NACα基因(MGG_02660)，命名为MoNACα，下载其CDS以及基因组序列，其中稻瘟菌MoNACαCDS的核苷酸系列如SEQIDNO：1所示，稻瘟菌MoNACα基因组核苷酸系列如SEQIDNO：2所示。1、构建HPH-GFP融合表达载体，并克隆出HPH-GFP片段分别用TRP-F/HYG-GFP-R和HYG-GFP-F/GFP-T引物对从pBHt2载体和PYBA1132载体扩增带有启动子TrpC的潮霉素HPH片段(1352bp，其核苷酸系列如SEQIDNO：19所示)和GFP片段(720bp，其核苷酸系列如SEQIDNO：20所示)。其中，TRP-F引物核苷酸系列如SEQIDNO：3所示，即：GCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA。HYG-GFP-R引物核苷酸系列如SEQIDNO：4所示，即：CTCGCCCTTGCTCACCATTTCCTTTGCCCTCGGACGAGT。HYG-GFP-F引物核苷酸系列如SEQIDNO：5所示，即：ACTCGTCCGAGGGCAAAGGAAATGGTGAGCAAGGGCGAG。GFP-T引物核苷酸系列如SEQIDNO：6所示，即：TCACTTGTACAGCTCGTCCAT。以前述产物HPH和GFP片段为模板，用TRP-F/GFP-T引物扩增，获得融合的HPH-GFP片段，并将该片段插入全式金pEASY-Blunt克隆载体，DNA测序鉴定是否存在突变，若有，则用M13-F/M13-R引物从克隆载体上克隆出HPH-GFP片段，备用。其中，M13-F引物核苷酸系列如SEQIDNO：7所示，即：TGTAAAACGACGGCCAGT。M13-R引物核苷酸系列如SEQIDNO：8所示，即：CAGGAAACAGCTATGACC。2、分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因的上、下游片段进行第一轮PCR分别扩增MoNACα基因上下游片段。用常规方法根据待敲除基因上下游片段的特性设计得到扩增引物AF/AR和BF/BR。在AR引物和BF引物5’端分别加入ACTGGCCGTCGTTTTACA和GGTCATAGCTGTTTCCTG接头序列。在稻瘟菌NACα基因的敲除中，分别用引物MGG_02660_AF/MGG_02660_AR和MGG_02660_BF/MGG_02660_BR从稻瘟菌基因组中扩增基因上游片段(595bp)和下游片段(550bp)。其中，MGG_02660_AF引物核苷酸系列如SEQIDNO：9所示，即：TATCCAATCGGCATTAGGG。MGG_02660_AR引物核苷酸系列如SEQIDNO：10所示，即：ACTGGCCGTCGTTTTACATTTCGCGGGTGGTCAA。MGG_02660_BF引物核苷酸系列如SEQIDNO：11所示，即：GGTCATAGCTGTTTCCTGACACTCGGTCTTGGTTTATTG。MGG_02660_BR引物核苷酸系列如SEQIDNO：12所示，即：TGAGGACGGAGCGGTAG。3、克隆待敲除基因上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段进行第二轮PCR扩增形成MoNACα基因上下游片段与HPH-GFP的嵌合体。以引物AF/GFP-R和HY-F/BR扩增模板，得到两个上下游片段-HPH-GFP的片段，1：1混合两个片段，备用。其中，GFP-R引物核苷酸系列如SEQIDNO：13所示，即：TCGCCGGACACGCTGAA。HY-F引物核苷酸系列如SEQIDNO：14所示，即：GCCGTGGTTGGCTTGTAT。4、用嵌合体片段转化真菌原生质体，得转化子备用1)原生质体制备：将新鲜的固体培养基上的菌丝切成小块(用手术刀背面轻轻刮)，置于液体完全培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建HPH‑GFP融合表达载体，并克隆出HPH‑GFP片段；(2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因的上、下游片段；(3)克隆待敲除基因上、下游片段与HPH‑GFP组成嵌合体片段；(4)用嵌合体片段转化真菌原生质体，得转化子备用；(5)将转化子置于含有潮霉素的培养基中进行培养，对正常生长出来的菌丝，用荧光显微镜观察并选择有GFP荧光的转化子，即为敲除突变体。

【技术特征摘要】
1.一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建HPH-GFP融合表达载体，并克隆出HPH-GFP片段；(2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因的上、下游片段；(3)克隆待敲除基因上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段；(4)用嵌合体片段转化真菌原生质体，得转化子备用；(5)将转化子置于含有潮霉素的培养基中进行培养，对正常生长出来的菌丝，用荧光显微镜观察并选择有GFP荧光的转化子，即为敲除突变体。2.根据权利要求1所述的丝状真菌基因敲除突变体的筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢鑫，王勇，蒋君梅，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52