The invention provides a method for constructing an Agrobacterium-mediated Aspergillus oryzae transgenic system with pyridinium thiamine as a screening marker. The method mainly comprises the following steps: (1) transforming a plant binary vector into a binary expression vector containing a prtA expression box containing a GPDA promoter and a GPF reporter gene; (2) transforming a binary vector into an Agrobacterium oryzae. AGL1; (3) Spores of Aspergillus oryzae were washed after 3 days in DPY medium; (4) Spores were co-cultured with Agrobacterium containing the target vector for 48 hours; (5) Spores were transferred to CD medium containing cephalosporin and pyridinium thiamine for screening; (6) Converters grown on the screening medium were further verified. The Agrobacterium-mediated transgene system with pyridinium thiamine as the screening marker is established for the first time, which reduces the workload and improves the transformation efficiency compared with the original protoplast-mediated transgene system, and lays a foundation for the genetic operation of Aspergillus oryzae.
【技术实现步骤摘要】
由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法
本专利技术涉及分子生物学
，进一步涉及米曲霉转基因体系构建技术，具体涉及一种由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法。
技术介绍
米曲霉作为食品安全级的真菌不仅在传统食品发酵、调味品和酿造等行业中具有十分悠久的应用历史，而且在诸如酶制剂、重组蛋白等现代生物技术产业中应用也日益广泛。米曲霉基因组在2005年已经测序完成，但是由于米曲霉对G418、潮霉素、寡霉素、博来霉素、腐草霉素、卡那霉素等常用的抗性药物均不敏感，因此其遗传操作困难，使得米曲霉功能基因研究进展缓慢。真菌常用的转基因方法有原生质体介导和农杆菌介导的两种。前者具有培养难度大、再生频率低、周期长并且操作复杂等缺点，使得其应用有一定局限性。而后者具有操作简单、转化效率高，并且T-DNA插入基因组稳定遗传等优点。虽然农杆菌介导的转基因技术在其它真菌比如酵母、红曲霉、黑曲霉中均已成功，但是由于米曲霉目前可用的抗性筛选标记较少和自身生长特性的原因，在这些常规孢子浓度、共培养时间和温度下均无法实现转基因。目前，使用农杆菌转化米曲...
【技术保护点】
1.由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)以pPTRⅠ载体为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的DNA片段为引物执行PCR扩增，得到ptrA表达盒；通过酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ将pEX1载体双酶切，将酶切产物与所述ptrA表达盒连接，得到pEX1‑ptrA载体；将所述pEX1‑ptrA载体转化至感受态的农杆菌AGL1株；2)将米曲霉3.042株的孢子接种于PDA或者DPY培养基培养3天，收集孢子；将收集物过滤后以4000rpm的转速离心10min，再用蒸馏水洗涤2次，得到孢子与水的混合物，调整...
【技术特征摘要】
1.由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)以pPTRⅠ载体为模板，以序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2的DNA片段为引物执行PCR扩增，得到ptrA表达盒；通过酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ将pEX1载体双酶切，将酶切产物与所述ptrA表达盒连接，得到pEX1-ptrA载体；将所述pEX1-ptrA载体转化至感受态的农杆菌AGL1株；2)将米曲霉3.042株的孢子接种于PDA或者DPY培养基培养3天，收集孢子；将收集物过滤后以4000rpm的转速离心10min，再用蒸馏水洗涤2次，得到孢子与水的混合物，调整其中孢子浓度至106个/mL，即得到孢子悬液；3)将步骤1)转化后的农杆菌AGL1株接种至10mL同时具有卡那霉素抗性和利福平抗性的LB培养基中，以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养；取1mL该培养液与9mLIM液体培养基混合，而后以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养6h，得到菌液；4)取100μL步骤3)所得菌液和100μL步骤2)所得孢子悬液，共涂布到铺有玻璃纸的IM固体培养基上，于22℃、避光培养48h；5)将玻璃纸取出，覆盖到同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，30℃培养5～7d；挑取长出的菌落，接种至另一新鲜的、同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，培养，长出的菌落即为阳性转化子。2.根据权利要求1所述的由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，其特征在于还包括以下步骤6)：取步骤5)所得的阳性转化子，提取其DNA，使用GFP特异性引物通过PCR验证其是否为...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡志宏，曾斌，孙云龙，牛亚丽，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36
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