一种检测线粒体的双光子红发射荧光探针制造技术

本发明专利技术提供了一种双光子红光发射的线粒体荧光探针及其在细胞成像中的应用，其化学名称为：2‑(芘‑1‑乙烯基)‑N‑己基‑喹啉碘盐；可通过以下步骤合成：2‑甲基喹啉与碘己烷在乙醇溶液中加热首先合成1,2‑二甲基喹啉碘盐；然后以四氢吡咯为催化剂，加入芘‑1‑甲醛在室温下缩合反应生成2‑(芘‑1‑乙烯基)‑N‑己基‑喹啉碘盐。本发明专利技术还提供了该荧光探针在成像线粒体的应用。本发明专利技术的探针合成方法简单，能够在单双光子显微镜下发出红光并成像线粒体，具有很大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种检测线粒体的双光子红发射荧光探针
本专利技术属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种双光子检测线粒体的荧光探针及其合成方法。
技术介绍
线粒体是一种双层膜结构包被的细胞器，存在于几乎所有种类的真核细胞中。线粒体通过氧化呼吸作用产生三磷酸腺苷(ATP)为细胞提供绝大部分能量。此外，线粒体还与信号转导、细胞凋亡、细胞分化的重要的生理病理过程直接相关。线粒体形态具有多变性，不同种类的细胞、细胞的不同阶段、不同的代谢状态和细胞状态均会影响线粒体的形态。因此观察线粒体形态和动态具有重要的生理和病理价值。目前扫描电镜、透射电镜和荧光显微镜是观察线粒体的重要工具。其中，荧光显微镜和荧光成像法可用于动态、原位、实时的观测活细胞中的线粒体变化，具有独特优势。因此，近年来得到了广泛的发展。而双光子荧光成像，作为荧光成像的一个亚种，更是因其无可比拟的优点受到了持续关注。与吸收一个紫外-可见光子到达激发态的单光子荧光过程不同，双光子过程吸收两个具有近红外发射的光子实现分子激发。特有的双光子吸收模式以及长的激发波长赋予了双光子成像穿透深度深、光漂白效应低和光损伤小等优点。此外，红发射分子可以有效避开动物细胞的自发荧光，更能够与双光子成像相辅相成。因此，开发双光子红光发射的线粒体荧光探针具有重要价值。而到目前为止，此类分子的报导依然较少，有待开发。
技术实现思路
针对目前双光子红光线粒体探针报导较少这一现状，本专利技术提供了一种双光子激发红光发射的线粒体荧光探针，该探针选择性好、灵敏度高。本专利技术的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。本专利技术的再一目的是提供一种上述荧光探针细胞成像中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种双光子激发红光发射的线粒体荧光探针，化学名称为2-(芘-1-乙烯基)-N-己基-喹啉碘盐，简称HVQ，其化学结构式如式（I）所示：式(I)。一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：2-甲基喹啉与碘己烷在乙醇中加热反应，反应完毕再加入1-芘甲醛和吡咯烷，室温搅拌反应，过滤得产物，即2-(芘-1-乙烯基)-N-己基-喹啉碘盐。上述步骤中，2-甲基喹啉、碘己烷和1-芘甲醛的摩尔比为1:1-2:0.8-1.2。2-甲基喹啉与吡咯烷的摩尔比为1:0.5-3。加热反应温度为80℃，时间为24-48h。搅拌反应时间为12-24h。作为优化，过滤后还包括提纯步骤。所述提纯步骤为产物用乙醇洗涤三遍后，在乙醇中重结晶。上述荧光探针的合成路线如下：。一种上述线粒体荧光探针在检测细胞线粒体中的应用。单光子激发波长为405nm，检测波段为570-620nm。双光子激发波长为800nm，检测波段为570-620nm。检测时间为作用30min后。上述荧光探针的工作原理如下：本专利技术以芘为母体，通过双键桥连喹啉盐构建了荧光探针。平面结构及内层电子跃迁保证了探针的双光子性质；合适大小的共轭结构以及强的吸电子基团保证了红光发射；阳离子盐和脂溶性保证了探针对线粒体的靶向性。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的荧光探针可经一锅法化学合成获得，合成步骤、分离纯化简单。探针具有双光子性质，在成像应用时穿透深度深、光漂白效应低、光损伤小；发射光为红光，能够有效避开动物细胞的自发荧光，具有较好的应用前景。附图说明图1为荧光探针HVQ的1HNMR谱；图2为荧光探针HVQ的高分辨质谱；图3为探针着色线粒体的单双光子成像图片；图4为探针与线粒体深红的共定位成像图片。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1荧光探针HVQ的合成以乙醇作溶剂，加入2-甲基喹啉，加入1.2eq的碘己烷溶液，加热至80℃反应24h，反应完毕后将反应体系冷却至室温，加入1eq的1-芘甲醛，加入1eq的吡咯烷，室温搅拌12h，有大量固体析出，过滤可得粗产物，粗产物用无水乙醇重新三遍，然后在乙醇中重结晶，得纯品2-(芘-1-乙烯基)-N-己基-喹啉碘盐，产率为48%。产物的1HNMR和HRMS谱图分别如图1和图2所示：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.32(d,J=15.2Hz,1H),9.19(d,J=8.9Hz,1H),9.03(dd,J=12.8,9.1Hz,2H),8.92(d,J=8.3Hz,1H),8.63(d,J=9.1Hz,1H),8.52–8.42(m,5H),8.39–8.30(m,2H),8.28-8.17(m,3H),8.01(t,J=7.5Hz,1H),5.24(d,J=8.4Hz,2H),2.00(d,J=7.5Hz,2H),1.60(q,J=7.6Hz,2H),1.45-1.21(m,4H),0.84(t,J=7.2Hz,3H).HRMS(ESI):m/zcalculatedforC33H30N443.2373[M+],found:443.2380。实施例2荧光探针HVQ的细胞成像（1）细胞培养、处理和染色将密度为3×105个/mL的HeLa细胞接种到灭菌的35mm成像培养皿中，在CO2培养箱（温度为37℃，5%CO2）培养12小时以上使细胞贴壁。用4%多聚甲醛处理贴壁细胞30min得到死细胞样品。配制浓度为2.5mM的实施例1制备的荧光探针的DMSO溶液为母液，向死活细胞培养皿中加入母液，使其终浓度均为5μM。继续分别在相同条件下继续培养1h，然后将细胞培养液吸走，用培养基冲洗细胞3次，然后进行细胞成像实验。（2）共聚焦显微镜成像分别以405nm和800nm为激发波长，红光通道收集波长为570-620nm，得到荧光图片如图3所示，其中，DIC为明场成像图，SPEF为单光子成像图，TPEF为双光子成像图，DIC-SPEF为两者的叠加图。从图中可以看出单、双光子显微镜下探针均能在红光通道给出强的荧光，且荧光信号呈现花丝状，符合线粒体的标准形态。实施例3探针与商业化探针在活细胞中的共定位为了进一步确认探针HVQ在细胞中的着色位置，我们用商用的线粒体染料线粒体深红(MTDR)与HVQ进行了共定位染色成像。活细胞共定位实验中，先用200nM的MTDR染色细胞30min，再加入2μM的HVQ染色细胞60min，然后将细胞培养液吸走，用培养基冲洗细胞3次，进行细胞成像。用405nm为激发波长，收集570-620nm的荧光来采集HVQ的荧光信号；用647nm为激发波长，收集663-738nm的荧光来采集MTDR的荧光信号。得到荧光图片如图4所示，其中，Redchannel为HVQ成像图，DRchannel为MTDR成像图，Mergedchannel为两者叠加图。计算得两种染料的复染率为90%，说明探针HVQ在活细胞中染色线粒体。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双光子激发红光发射的线粒体荧光探针，化学名称为2‑(芘‑1‑乙烯基)‑N‑己基‑喹啉碘盐，其化学结构式如式（I）所示：

【技术特征摘要】
1.一种双光子激发红光发射的线粒体荧光探针，化学名称为2-(芘-1-乙烯基)-N-己基-喹啉碘盐，其化学结构式如式（I）所示：式(I)。2.根据权利要求1所述的线粒体荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：2-甲基喹啉与碘己烷在乙醇中加热反应，反应完毕再加入1-芘甲醛和吡咯烷，室温搅拌反应，过滤得产物，即2-(芘-1-乙烯基)-N-己基-喹啉碘盐。3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，2-甲基喹啉、碘己烷和1-芘甲醛的摩尔比为1:1-2:...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，孙洁，田明刚，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37