乙酸CoA转移酶缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用，所述大肠杆菌工程菌构建了由多个基因构成的异丙醇合成途径的工程菌，并通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸CoA转移酶的编码基因获得。本发明专利技术提供的异丙醇合成途径由乙酰乙酰基辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A裂解酶、乙酰乙酸脱羧酶以及二级乙醇脱氢酶组成，并能够实现在生物体内以乙酰辅酶A为起始代谢物向异丙醇的转化。本发明专利技术提供的突变体菌株内表达本发明专利技术提供的编码组成异丙醇合成代谢途径中所有的酶的基因获得。本发明专利技术所构建的重组大肠杆菌菌株在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖或甘油的丰富培养基为原料合成364 mg/L异丙醇。

【技术实现步骤摘要】
乙酸CoA转移酶缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及乙酸CoA转移酶缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用。
技术介绍
异丙醇(isopropanol)为一种仲醇。在传统工业中主要用于制药、化妆品、塑料、香料、涂料及电子工业上用作脱水剂及清洗剂。随着当今社会日益增长的能源需求，其在能源方面的应用得到重视和开发。异丙醇既可以被用作生物燃料来部分代替石化汽油，亦可取代甲醇来酯化脂肪和油从而合成生物柴油，也可脱水后生成目前只能从石油中提炼获得的丙烯。目前异丙醇的生产主要是基于丙烯或丙酮为原料的化工路线。化学合成法工艺较为复杂且常需高温高压，具有高能耗高物耗的特性，增加了其合成成本。另外，化学合成法还会导致严重的环境污染。传统的生物技术产业已经或正在发生技术上和结构上的重大调整，已向微生物细胞工厂方和高效生物催化为核心的生物炼制技术方向发展，传统的生物工艺逐渐地被高效、低能耗和低污染的绿色工艺和技术所取代。在自然界中，一些梭菌中天然存在着异丙醇的代谢合成途径。该途径被认为是异丙醇合成的模式途径，起始于乙酰辅酶A经过乙酰乙酸和丙酮，最终合成异丙醇。首先，两分子的乙酰辅酶A在乙酰辅酶A酰基转移酶(ACoAAT)的催化下脱去辅酶A生成一分子乙酰乙酰基辅酶A。其次，生成的乙酰乙酰基辅酶A在乙酰乙酸转移酶(atoD和atoA)的作用下产生乙酰乙酸，并将辅酶A转移至乙酸上再生成乙酰辅酶A。随后，乙酰乙酸被乙酰乙酸脱羧酶(ADC)转化为丙酮和二氧化碳。最终，丙酮在二级乙醇脱氢酶(SADH)的催化下生成异丙醇。该途径已被构建于不同宿主微生物中用于合成异丙醇。但该代谢途径涉及乙酸的富集，理论上这不利于菌体的生长。此外，该途径依赖乙酰乙酸转移酶atoD和atoA催化的乙酰乙酸的合成。然而，乙酰乙酸转移酶更倾向于乙酰乙酸的降解而非合成，不利于代谢产物异丙醇的合成。
技术实现思路
专利技术目的：为解决现有技术的不足，本专利技术设计了一种不涉及乙酸富集以及不依赖乙酰乙酸转移酶atoD和atoA的新的异丙醇合成途径，并引入大肠杆菌，通过敲除大肠杆菌基因组上atoD和atoA基因达到阻断乙酰乙酸降解途径的目的。本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌。本专利技术还要解决的技术问题是提供了所述的乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌在生产异丙醇方面的应用。本专利技术最后要解决的技术问题是提供了一种生产异丙醇的方法。技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌构建了由多个基因构成的异丙醇合成途径的工程菌，并通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸CoA转移酶的编码基因获得。其中，本专利技术所述由多个基因构成的异丙醇合成途径中的多个基因包含编码乙酰乙酰基辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A裂解酶、乙酰乙酸脱羧酶以及二级乙醇脱氢酶的基因。其中，本专利技术所述大肠杆菌工程菌通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸CoA转移酶的编码基因atoD和atoA获得。其中，本专利技术所述宿主大肠杆菌包括EscherichiacoliBL21、BL21pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌中的一种。其中，本专利技术所述异丙醇合成途径中编码该途径中所有基因的载体为pTrc99A系列表达载体、pSTV28系列表达载体、pET21系列表达载体或pBR322系列载体中的一种或几种。本专利技术所述的异丙醇合成途径为一种全新的途径。该途径的起始代谢物为乙酰辅酶A。乙酰辅酶A首先被转化为乙酰乙酰辅酶A；乙酰乙酰基辅酶A随后在羟甲戊二酸单酰辅酶A合成酶(HMGS)的作用下与乙酰辅酶A缩合成羟甲戊二酸单酰辅酶A并释放辅酶A；而羟甲戊二酸单酰辅酶A随后则在羟甲戊二酸单酰辅酶A裂解酶(HMGL)的催化下生成乙酰辅酶A和乙酰乙酸；乙酰乙酸再被乙酰乙酸脱羧酶(ADC)转化为丙酮和二氧化碳。最终，丙酮在二级乙醇脱氢酶(SADH)的催化下生成异丙醇(图1)。其中，本专利技术所述编码乙酰乙酰基辅酶A合成酶的基因atoB来自大肠杆菌，编码羟甲戊二酸单酰辅酶A合成酶的基因HMGS来自粪肠球菌，编码羟甲戊二酸单酰辅酶A裂解酶的基因HMGL来自假单胞菌，编码乙酰乙酸脱羧酶的基因ADC和二级乙醇脱氢酶的基因SADH均来自产丁酸梭菌。其中，本专利技术所述的异丙醇合成新途径中编码羟甲戊二酸单酰辅酶A裂解酶的基因HMGL，其基因序列经密码子优化后由人工合成获得，所述优化后的基因HMGL的DNA序列如SEQNO：1所示。其中，本专利技术所述的异丙醇合成新途径中编码乙酰乙酸脱羧酶的基因ADC及编码二级乙醇脱氢酶的基因SADH，其基因序列经密码子优化后由人工合成获得，所述优化后的基因ADC与基因SADH串联的DNA序列如SEQNO：2所示。其中，本专利技术所述的异丙醇合成新途径中的所有基因在进行聚合酶链式反应扩增时均人为添加了核糖体结合位点序列。由于乙酸CoA转移酶的编码基因为atoD和atoA。进一步的，乙酰乙酸转移酶更倾向于乙酰乙酸的降解而非合成，不利于代谢产物异丙醇的合成，本专利技术所述的异丙合成涉及敲除宿主细菌基因组上的atoD和atoA基因(图2)。其中，上述的表达载体及带有核糖体结合位点序列的异丙醇合成途径的基因中，所述的带有核糖体结合位点序列的异丙醇合成途径的所有基因排列在上述的列出的任一载体上的多克隆酶切位点启动子下游，且以任意次序组合排列。本
技术实现思路
还包括所述的乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌在生产化合物中的应用。其中，所述化合物包括乙酸、乙醇、丙酮和异丙醇，其中，异丙醇为本专利技术的目标产物。本
技术实现思路
还包括一种生产异丙醇的方法，即将所述的大肠杆菌工程菌得到异丙醇的步骤，具体地，在发酵过程中通入空气，消耗甘油、葡萄糖或其它碳源，生产异丙醇，其中：所述发酵温度为25-38℃；所述发酵体系的pH值为6.5-7.5；发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖和淀粉中的一种或几种；发酵培养基中的氮源为酵母粉、蛋白胨、氨水、铵盐和尿素中的一种或几种。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除其基因组乙酸CoA转移酶的编码基因atoD和atoA，并在该突变体菌株内表达本专利技术提供的编码组成异丙醇合成代谢途径中所有的酶的基因获得。本专利技术所构建的重组大肠杆菌菌株在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖或甘油的丰富培养基为原料合成364mg/L异丙醇。附图说明图1为本专利技术中新型异丙醇合成代谢途径；图2为本专利技术中敲除大肠杆菌基因组乙酸CoA转移酶的编码基因atoD和atoA以阻断乙酰乙酸向乙酰乙酰辅酶A的转化；图3为本专利技术中pT-ISOP1的质粒图谱；图4为本专利技术中大肠杆菌工程菌MG1655MGΔatoDA产异丙醇的时间曲线图；图5为标准品的气相检测图谱；图6为工程菌MG1655ΔatoDA：pT-ISOP1以葡萄糖为碳源的异丙醇合成气相检测图谱。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌构建了由多个基因构成的异丙醇合成途径的工程菌，并通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸CoA转移酶的编码基因获得。

【技术特征摘要】
1.一种乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌构建了由多个基因构成的异丙醇合成途径的工程菌，并通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸CoA转移酶的编码基因获得。2.根据权利要求1所述的乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述由多个基因构成的异丙醇合成途径中的多个基因包含编码乙酰乙酰基辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶A裂解酶、乙酰乙酸脱羧酶以及二级乙醇脱氢酶的基因。3.根据权利要求1所述的乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸CoA转移酶的编码基因atoD和atoA获得。4.根据权利要求1所述的乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述宿主大肠杆菌包括EscherichiacoliBL21、BL21pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌中的一种。5.根据权利要求1所述的乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述异丙醇合成途径中编码该途径中所有基因的载体为pTrc99A系列表达载体、pSTV28系列表达载体、pET21系列表达载体或pBR322系列载体中的一种或几种。6.根据权利要求2所述的乙酸CoA转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述编码乙酰乙酰基辅酶A合成酶的基因atoB来自大肠杆菌，所述编码羟甲戊...

【专利技术属性】
技术研发人员：周佳，田宝霞，李相前，
申请(专利权)人：淮阴工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32