被遗传修饰以分泌多糖降解酶的利用乳酸的细菌制造技术

提供了利用乳酸(LA)的细菌，其被遗传修饰以表达和任选地分泌多糖降解酶，例如纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶，及其用途。多糖降解酶有利于处理有机废物，使得有机废物可以用作工业发酵方法中的底物，特别是分离的乳酸对映体的工业生产。还提供了用于遗传修饰利用LA的细菌的载体和构建体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】被遗传修饰以分泌多糖降解酶的利用乳酸的细菌
本专利技术涉及双重作用的利用乳酸(LA)的细菌，其被遗传修饰以分泌多糖降解酶，如纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶，用于处理有机废物以除去废物中存在的乳酸并降解复合多糖，由此为工业发酵方法提供底物，产生各种生物化学品，包括特定的乳酸对映体。
技术介绍
近年来，由于能够在生物塑料的制造中使用乳酸作为基础材料，乳酸发酵，即通过微生物发酵从碳水化合物来源生产乳酸，已经引起人们的兴趣。乳酸可以聚合形成可生物降解和可回收的聚酯聚乳酸(PLA)，其被认为是由石油制造的塑料的潜在替代品。PLA用于制造各种产品，包括食品包装、一次性用品、纺织品和卫生用品产业的纤维等。由于各种考虑因素，包括环境问题、成本和通过化学合成产生对映体纯的乳酸的困难，通过发酵生物过程产生乳酸优于化学合成方法，这是大多数工业应用所需的。常规的发酵方法典型地基于产乳酸微生物在分批、补料分批、连续或半连续反应器中的厌氧发酵，例如乳杆菌属的细菌，其产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物(Abdel-Rahmanetal.(2013)BiotechnologyAdvances,31:877–902；Ghaffaretal.(2014)JournalofRadiationResearchandAppliedSciences,7(2):222–229)。为了生产PLA，通过各种方法将发酵过程中产生的乳酸与发酵液分离，例如包括溶剂萃取、电渗析、蒸馏的方法，或一种或多种方法组合。然后将纯化的乳酸进行聚合。乳酸具有手性碳原子，因此以两种对映体形式存在，即D-和L-乳酸。为了产生适用于工业应用的PLA，聚合方法应仅使用一种对映体。存在杂质或D-和L-乳酸的外消旋混合物导致聚合物具有不希望的特性，例如低结晶度和低熔融温度。因此，需要仅产生L-乳酸对映体或仅产生D-乳酸对映体的乳酸菌。在目前可用的商业方法中，碳水化合物来源通常是含淀粉的可再生来源，例如玉米和木薯根。也已提出另外的来源，例如富含纤维素的甘蔗渣。典型地，乳酸菌可以利用还原糖如葡萄糖和果糖，但不具有降解多糖如淀粉和纤维素的能力。因此，为了利用这种多糖，该方法需要加入糖酵解酶，典型地与化学处理组合，以降解多糖并释放还原糖。Sakaietal.,2004JournalofIndustrialEcology,7(3-4):63-74报道了一种市政食物废物回收系统，它结合发酵和化学方法生产聚L-乳酸(PLLA)。食物废物典型地包括不同比例的还原糖(葡萄糖，果糖，乳糖等)、淀粉和木质纤维素材料。Sakai等人的方法包括用葡糖淀粉酶进行切碎和灭菌食物废物的处理，以将食物废物中的淀粉降解成可溶性葡萄糖，使用形成L-乳酸的细菌进行L-乳酸发酵，以及纯化和聚合步骤以获得PLLA。对于Sakai等人使用的特定碳水化合物来源，即食物废物，由于食物废物含有为了获得最终的纯L-或D-乳酸而需要除去的内源性D-、L-乳酸(例如来自乳制品)，因此该过程很复杂。因此，Sakai等人的方法进一步包括在乳酸发酵步骤之前通过消耗乳酸作为碳源的丙酸杆菌从食物废物中除去内源性D-、L-乳酸。Sakai等人的方法仅利用食物废物中50％的碳含量，并转化为乳酸。此外，虽然食物废物含有还原糖、淀粉和木质纤维素，但Sakai等人的方法没有使用后者，因为乳酸菌不能直接利用这种碳水化合物来源。US7,507,561公开了一种由可再生农业原料发酵生产聚乳酸的方法，该原料包含用作原料的糖蜜或甘蔗渣。US8,119,376公开了一种生产乳酸或其盐的方法，其中淀粉经历同时糖化和发酵的过程，该方法包括在至少包含葡糖淀粉酶的培养基中糖化淀粉并同时使用微生物发酵淀粉，任选地从培养基中分离乳酸，其特征在于使用产生中等嗜热性乳酸的微生物。本专利技术进一步涉及在产生中等嗜热性乳酸的微生物存在下实施所述过程的方法，该微生物已适应了在工作pH下具有其最大性能。EP2843039公开了一种制备产生D-乳酸的菌株的方法，该菌株经过修饰以抑制L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性并在产生L-乳酸的菌株中引入D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性；通过上述方法制备的突变的生产D-乳酸的菌株，和生产D-乳酸的方法，包括培养该菌株和从培养基中回收D-乳酸的步骤。WO2011/098843公开了一种生产乳酸或其盐的方法。该方法描述了淀粉材料同时进行淀粉糖化以及由所选择的产生淀粉分解酶的细菌将其糖发酵成乳酸。Moraisetal.,2013AppliedandEnvironmentalMicrobiology,79(17):5242–5249报道了将编码纤维素酶或木聚糖酶的基因导入植物乳杆菌，并建立了分泌纤维素酶和木聚糖酶的双菌株细胞联合体。在麦秆中评估细胞联合体的酶活性。WO2015011250公开了用于通过细菌产生和分泌目的物质的载体及其应用。WO2015/097685公开了用于加工木质纤维素的乳酸细胞培养物。细菌培养物可包含生物质组合物和乳酸菌群，其包含：(i)第一种乳酸菌群，其已被遗传修饰以表达分泌的纤维素酶；和(ii)第二种乳酸菌群，其已被遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶，其中选择第一群体：第二群体的比例，使得培养物中纤维素酶：木聚糖酶的比活性大于4：1或小于1：4。WO2015/097686公开了乳酸菌培养物、细胞群和包含其的用于从木质纤维素产生乙醇的制品。迄今描述的由可再生资源生产乳酸的方法具有许多缺点，例如碳—乳酸转化率低，需要许多单独步骤的复杂程序，成本相对高，和可以使用的碳水化合物来源有限。另外，一些方法是不利的，因为使用作为人类食物具有高价值的源材料。因此需要用于有效处理各种含碳水化合物的来源的细菌、组合物和方法，例如包括富含淀粉的材料、富含木质纤维素的材料或其组合的有机废物，以获得适合用于工业发酵方法的大量可溶性还原糖。
技术实现思路
根据一些方面，本专利技术提供了利用乳酸(LA)的细菌，其被基因工程改造以产生一种或多种多糖降解酶，特别是糖苷水解酶，例如纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶。本文公开的基因工程改造的双重作用的利用LA的细菌，除了它们选择性地消耗和代谢乳酸的天然能力，在某些条件下基本上不利用其他还原糖之外，还促进有机废物(例如食物和农业废物)中发现的复杂多糖的降解。这种利用LA的基因工程细菌令人惊讶地提供了用于处理有机废物的改进方法，使废物糖化并除去废物中存在的内源性乳酸。然后，经处理的废物可用作工业发酵方法中的底物，特别是由产乳酸微生物生产特定的分离的乳酸对映体。本文公开的利用LA的细菌有利于处理各种有机废物，包括各种各样的食物废物以及植物材料和人造材料，例如纸。在一些实施方案中，本文公开的利用LA的细菌特别适用于商业、工业和市政来源的混合食物废物。本文公开的利用LA的细菌能够有效且成本效率高地处理有机废物，并且根据一些实施方案，有效且成本效率高地生产乳酸，其特征在于与其他方法相比碳—乳酸转化率提高。本文公开的利用LA的细菌的其它优点是当用于处理废物时，该方法不需要向处理物中添加外来降解酶，因为这种酶由该细菌产生。因此，通过避免添加这种外来酶的需要(即，将酶添加到处理所发生的容器中)，实现了有利的过程，其具有更高的成本效率并且更加稳健，因为污染的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用乳酸(LA)的细菌，其被遗传修饰以表达和分泌一种或多种外源多糖降解酶，其中所述一种或多种外源多糖降解酶包括纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶或其组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.11 US 62/276,9851.一种利用乳酸(LA)的细菌，其被遗传修饰以表达和分泌一种或多种外源多糖降解酶，其中所述一种或多种外源多糖降解酶包括纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶或其组合。2.根据权利要求1所述的利用LA的细菌，其中所述多糖降解酶是细菌酶。3.根据权利要求2所述的利用LA的细菌，其中细菌多糖降解酶来自嗜热细菌。4.根据权利要求3所述的利用LA的细菌，其中所述嗜热细菌选自梭菌属物种、类芽孢杆菌属物种、褐色喜热裂孢菌、芽孢杆菌属物种、地芽孢杆菌属物种、色盐杆菌属物种和海洋红嗜热盐菌组成的组。5.根据权利要求2所述的利用LA的细菌，其中细菌多糖降解酶来自嗜温细菌。6.根据权利要求5所述的利用LA的细菌，其中所述嗜温细菌选自克雷伯氏菌属物种、Cohnellasp.、链霉菌属物种、解纤维素醋弧菌、色白瘤胃球菌；芽孢杆菌属物种和发酵乳杆菌所组成的组。7.根据权利要求1所述的利用LA的细菌，其中所述多糖降解酶是真菌酶。8.根据权利要求7所述的利用LA的细菌，其中所述真菌酶选自里氏木霉、特异腐质霉、尖孢镰刀菌、米曲霉、瘿青霉和棉状嗜热丝孢菌组成的组。9.根据权利要求1所述的利用LA的细菌，其中所述多糖降解酶在与适合所述利用LA的细菌生长的温度和pH范围相同的温度和pH范围内具有合适的活性。10.根据权利要求1所述的利用LA的细菌，其中所述多糖降解酶在高于适合所述利用LA的细菌生长的合适温度下具有合适的活性。11.根据权利要求1所述利用LA的细菌，其中多糖降解酶在高于或低于适合所述利用LA的细菌生长的pH的pH下具有合适的活性。12.根据权利要求1所述的利用LA的细菌，其中所述利用LA的细菌选自丙酸杆菌属、巨球形菌属物种、月形单胞菌属物种和韦荣氏球菌属物种组成的组。13.根据权利要求12所述利用LA的细菌，其中所述利用LA的细菌是丙酸杆菌属物种。14.根据权利要求13所述利用LA的细菌，其中所述丙酸杆菌属物种是费氏丙酸杆菌。15.一种利用乳酸(LA)的细菌群，其被遗传修饰以表达和分泌多种外源多糖降解酶，所述酶包括纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶或其组合，其中所述群包含多个利用LA的细菌亚群，每个亚群被遗传修饰以表达和分泌不同的多糖降解酶。16.根据权利要求15所述的利用LA的细菌群，其中所述多糖降解酶是细菌酶。17.根据权利要求16所述的利用LA的细菌群，其中所述多糖降解酶来自嗜热细菌。18.根据权利要求17所述的利用LA的细菌群，其中所述嗜热细菌选自梭菌属物种、类芽孢杆菌属物种、褐色喜热裂孢菌、芽孢杆菌属物种、地芽孢杆菌属物种、色盐杆菌属物种和海洋红嗜热盐菌组成的组。19.根据权利要求16所述的利用LA的细菌群，其中所述多糖降解酶来自嗜温细菌。20.根据权利要求19所述的利用LA的细菌群，其中所述嗜温细菌选自克雷伯氏菌属物种、物种Cohnellasp.、链霉菌属物种、解纤维素醋弧菌、色白瘤胃球菌；芽孢杆菌属物种和发酵乳杆菌组成的组。21.根据权利要求15所述的利用LA的细菌群，其中所述多糖降解酶是真菌酶。22.根据权利要求21所述的利用LA的细菌群，其中所述真菌酶选自里氏木霉、孤独腐质霉、尖孢镰刀菌、米曲霉、瘿青霉和棉状嗜热丝孢菌组成的组。23.根据权利要求15所述的利用LA的细菌群，其中所述亚群是相同细菌物种的亚群。24.根据权利要求15所述的利用LA的细菌群，其中所述亚群是不同细菌物种的亚群。25.根据权利要求15所述的利用LA的细菌群，其中所述利用LA的细菌选自丙酸杆菌属(Propionibacterium)物种。26.根据权利要求25所述的利用LA的细菌群，其中所述丙酸杆菌属物种是费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)。27.一种处理有机废物的方法，所述方法包括在利用LA的细菌消耗乳酸和适合多糖降解酶的表达和活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·沙皮拉，A·奥兰尼，
申请(专利权)人：三PLW有限责任公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL