一种木糖醇基因工程生产菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种木糖醇基因工程生产菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。所述的木糖醇基因工程生产菌，由大肠杆菌W3110经基因组改造得到，原始大肠杆菌W3110基因组中的ptsG、xylAB和ptsF均替换成木糖还原酶基因XR；还包括基因组中pfkA、pfkB、pgi、sthA中的至少一个替换成XR。本发明专利技术以大肠杆菌W3110为出发菌株，将基因组中的相应基因均替换成XR，木糖还原酶得以高效表达，同时通过阻断木糖的代谢和木糖醇的磷酸化，提高对木糖的利用，并且通过阻断或减少EMP途径葡萄糖代谢通量强化NADPH再生，为木糖还原酶还原木糖生成木糖醇提供必需的辅酶NADPH，极大提高基因工程菌转化木糖生产木糖醇的效率。

Xylitol gene engineering producing strain and its construction method and Application

The invention discloses a xylitol genetic engineering producing strain and its construction method and application, belonging to the field of genetic engineering technology. The xylitol genetic engineering producing bacteria were obtained from E. coli W3110 by genome modification. The ptsG, xylAB and ptsF in the original E. coli W3110 genome were replaced by xylose reductase gene XR, and at least one of the pfkA, pfkB, PGI and sthA in the genome was replaced by XR. The present invention takes Escherichia coli W3110 as the starting strain, replaces the corresponding genes in the genome with XR, and the xylose reductase can be highly expressed. At the same time, the utilization of xylose can be improved by blocking xylose metabolism and xylitol phosphorylation, and the NADPH regeneration can be enhanced by blocking or reducing the glucose metabolic flux through EMP pathway. Xylose reductase provides the necessary coenzyme NADPH to reduce xylose to xylitol, which greatly improves the efficiency of transformation of xylose to xylitol by genetically engineered bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种木糖醇基因工程生产菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种木糖醇基因工程生产菌及其构建方法和应用。
技术介绍
木糖醇是一种五碳糖醇，其甜度与蔗糖相当，热量值却只有其60％左右，木糖醇具有抗龋齿及代谢不依赖胰岛素、改善肝功能等特点，广泛应用于食品、医药和化工行业。工业上生产木糖醇主要是利用半纤维素酸水解获得木糖，经分离纯化后得到纯度在95％以上的木糖在高温高压条件下用镍催化加氢制得，这种工艺条件苛刻，且容易造成污染，生产成本较高。生物法生产木糖醇不需要高温高压条件、易燃易爆氢气、污染环境的镍催化剂和高纯度的木糖等，反应条件温和、安全节能且环境友好，所以生物法转化生产木糖醇越来越受到人们的重视。目前用于发酵法制备木糖醇的微生物几乎都是酵母菌，既有自然菌种，也有基因工程菌。酵母菌作为木糖醇生产菌株有着自己的优势，比如能耐受较高的糖浓度，对半纤维素水解液中的抑制因子抵抗性较强，等等。但是也存在不可回避的问题，如具有潜在的致病性、酵母本身所含有的木糖还原酶专一性较差等。大肠杆菌作为生产各种高附加值化学品的理想宿主，当前研究最为透彻，基因背景清楚，利用其构建基因工程菌有着得天独厚的条件。以大肠杆菌作为宿主生产木糖醇已有报道，如苏卜利等基于质粒载体系统构建了第一代高产木糖醇菌株，利用质粒载体进行蛋白的表达，通过mRNA二级结构的调节，构建了一个能在较高温度下高效可溶表达的质粒；在30℃条件下，酶活是出发菌株的5.68倍。通过敲除葡萄糖磷酸转移酶系统中酶Ⅱ组分的ptsG基因，消除菌株的代谢物阻遏效应，使菌株能同时转运葡萄糖和木糖；敲除菌株自身代谢木糖的基因xylA和xylB，阻断木糖的代谢利用；敲除可转运木糖醇的果糖磷酸转移酶系统中酶Ⅱ组分的ptsF基因，减少木糖醇的磷酸化；通过一系列的优化，木糖醇生产效率是出发菌株的8.71倍(“大肠杆菌基因工程菌转化半纤维素水解液生产木糖醇的研究”，苏卜利，《浙江大学》，2016年)。辅酶是一大类有机辅因子的总称，是酶催化氧化还原反应等所必须的辅助因子。它们在反应中充当传递电子、原子或基团的作用，辅酶在一定程度上可以看作是酶反应中的第二底物。作为微生物代谢网络中的一种关键辅因子，通过调节细胞内的辅酶含量和还原型氧化型的比例可定向改变和优化微生物的细胞代谢功能，从而实现代谢流的最大化，这也是增加目标产物的重要方法之一。辅酶NAD(P)H在各类酶催化反应中都起着重要作用，尤其是氧化还原反应中，都需要辅酶NAD(P)H作为电子传递参与反应。在产物合成的过程中，会消耗一定量的辅酶。因此随着反应的进行胞内的辅酶含量减少，导致催化效率降低。由于辅酶价格昂贵，通过外源添加的方式进行补充是不现实的。因此通过代谢工程调控微生物的代谢过程，提高胞内NADPH的浓度，不仅能有效的提高生产效率降低成本，也能更好地保证生物转化过程的正常进行。从技术经济的角度来看，强化辅酶再生循环意义重大。目前，基于辅酶NADPH的代谢工程改造主要方法为增强PPP的代谢通量。在大肠杆菌中，葡萄糖主要存在两条代谢途径，包括糖酵解途径(EMP途径)和磷酸戊糖途径(PPP途径)。其中PPP途径中有2步反应能实现NADPH的再生，现有的研究中通过过表达这两步反应中的zwf和gnd基因来提高内源性辅酶NADPH，该方法能在一定程度上强化胞内NADPH的再生。但在整合型表达木糖还原酶基因的大肠杆菌中，要实现木糖还原酶酶活与辅酶再生速率的匹配，需要进一步降低葡萄糖的消耗速率。目前未见利用阻断或减少EMP途径葡萄糖代谢通量的方法实现辅酶NADPH再生强化和减慢葡萄糖利用速率方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以大幅度提升木糖醇生产效率的木糖醇基因工程生产菌。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术以大肠杆菌W3110为出发菌株，利用基因替换技术对原始菌株基因组中的影响木糖代谢通路及葡萄糖代谢通路中的基因进行替换，以实现木糖还原酶活与辅酶再生速率的匹配，进而提升基因工程菌转化木糖生产木糖醇的效率。因此，本专利技术提供了一种木糖醇基因工程生产菌，由大肠杆菌W3110经基因组改造得到，原始大肠杆菌W3110基因组中的ptsG、xylAB和ptsF均替换成木糖还原酶基因XR；还包括基因组中pfkA、pfkB、pgi、sthA中的至少一个替换成木糖还原酶基因XR。所述的大肠杆菌W3110购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ，编号为DSM-5911。本专利技术对大肠杆菌W3110的改造包括：(1)在大肠杆菌细胞内存在代谢木糖的途径：木糖经过木糖异构酶(xylA)生成木酮糖，木酮糖在木酮糖激酶(xylB)的作用下生成5-磷酸木酮糖，5-磷酸木酮糖进入磷酸戊糖途径被代谢掉。同时果糖的磷酸转移酶(ptsF)途径可能也参与了木糖醇的转运，使木糖醇进入细胞的同时被磷酸化，而磷酸化的木糖醇对细胞有毒害作用，因此将基因组中xylAB和ptsF替换成木糖还原酶基因XR，阻断木糖的代谢和木糖醇的磷酸化的同时增加木糖还原酶的表达，有利于工程菌高效转化木糖生产木糖醇。(2)大肠杆菌利用糖时存在葡萄糖效应，即在有葡萄糖存在时，大肠杆菌对其他糖如木糖、阿拉伯糖等的利用都会受到严重抑制，因此，本专利技术将葡萄糖磷酸转移酶基因ptsG替换成木糖还原酶基因XR，降低基因工程菌对葡萄糖的利用速率，消除葡萄糖效应。但是木糖还原酶还原木糖生成木糖醇的过程中，需要葡萄糖作为辅底物提供反应必需的辅酶NADPH。因此，本专利技术将参与糖酵解途径(EMP)的基因pfkA、pfkB、pgi或sthA进行替换，以阻断或减少EMP途径葡萄糖代谢通量，实现PPP途径辅酶NADPH再生强化和减慢葡萄糖利用速率。作为优选，原始大肠杆菌W3110基因组中的ptsG、xylAB、ptsF、pfkA和pfkB均替换成木糖还原酶基因XR。研究表明，上述5个基因均被替换成木糖还原酶基因XR后，基因工程菌转化木糖生产木糖醇的生产效率达到1.92g/L。所述木糖还原酶基因XR来源于粗糙脉孢菌，基因序列参见NCBI登录号NCU08384.1。本专利技术还提供了一种构建上述木糖醇基因工程生产菌的构建方法，包括以下步骤：(1)将大肠杆菌W3110基因组中的ptsG、xylAB和ptsF均替换成木糖还原酶基因XR，得到第一代基因工程菌；(2)将第一代基因工程菌基因组中的pfkA，pfkB，pgi，sthA中的至少一个替换成木糖还原酶基因XR。步骤(1)和(2)中，利用同源重组技术进行基因替换。具体地，步骤(1)中，包括：a.利用特异性引物分别构建替换ptsG、xylAB和ptsF基因的pTargetF质粒及对应的含有XR表达模块的修复模板；b.将替换ptsG基因的pTargetF质粒和修复模板转化入含有pCas质粒的大肠杆菌W3110中，经同源重组，筛选获得基因组中ptsG基因替换成XR表达模块的菌株W3110△ptsG::XR；再将替换xylAB基因的pTargetF质粒和修复模板转化入菌株W3110△ptsG::XR中，经同源重组，筛选获得基因组中xylAB基因替换成XR表达模块的菌株W3110△ptsG::XR,△xylAB::XR；然后将替换ptsF基因的pTargetF质粒和修复模本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木糖醇基因工程生产菌，由大肠杆菌W3110经基因组改造得到，其特征在于，原始大肠杆菌W3110基因组中的ptsG、xylAB和ptsF均替换成木糖还原酶基因XR；还包括基因组中pfkA、pfkB、pgi、sthA中的至少一个替换成木糖还原酶基因XR。

【技术特征摘要】
1.一种木糖醇基因工程生产菌，由大肠杆菌W3110经基因组改造得到，其特征在于，原始大肠杆菌W3110基因组中的ptsG、xylAB和ptsF均替换成木糖还原酶基因XR；还包括基因组中pfkA、pfkB、pgi、sthA中的至少一个替换成木糖还原酶基因XR。2.如权利要求1所述的木糖醇基因工程生产菌，其特征在于，原始大肠杆菌W3110基因组中的ptsG、xylAB、ptsF、pfkA和pfkB均替换成木糖还原酶基因XR。3.如权利要求1或2所述的木糖醇基因工程生产菌，其特征在于，所述木糖还原酶基因XR来源于粗糙脉孢菌。4.如权利要求1所述的木糖醇基因工程生产菌的构建方法，包括以下步骤：(1)将大肠杆菌W3110基因组中的ptsG、xylAB和ptsF均替换成木糖还原酶基因XR，得到第一代基因工程菌；(2)将第一代基因工程菌基因组中的pfkA，pfkB，pgi，sthA中的至少一个替换成木糖还原酶基因XR。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，利用同源重组技术进行基因替换。6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，包括：a.利用特异性引物分别构建替换ptsG、xylAB和ptsF基因的pTargetF质粒及对应的含有XR表达模块的修复模板；b.将替换ptsG基因的pTargetF质粒和修复模板转化入含有pCas质粒的大肠杆菌W3110中，经同源重组，筛选获得基因组中ptsG基因替换成XR表达模块的菌株W3110△ptsG::XR；再将替换xylAB基因的pTargetF质粒和修复模板转化入菌株W3110△ptsG::XR中，经同源重组，筛选获得基因组中xylAB基因替换成XR...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴绵斌，王吉平，袁新松，林建平，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33