本发明专利技术涉及一种重组恶臭假单胞菌及其用于生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的方法，属于发酵工程领域。本发明专利技术的技术方案是：一株重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN‑18，其菌种保藏编号为：CGMCC No.15734，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。发明专利技术成功实现了来源于自身内源性质粒上的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶在恶臭假单胞菌P.putida ATCC33015中过表达，并以此重组菌P.putidaJN‑18全细胞催化2,5‑二甲基吡嗪生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸。
A recombinant Pseudomonas putida and its application
The invention relates to a recombinant Pseudomonas putida and a method for producing 5 methylpyrazine 2 carboxylic acid, belonging to the field of fermentation engineering. The technical scheme of the invention is: a recombinant Pseudomonas putida JN 18 strain of Pseudomonas putida, whose preservation number is CGMCC No. 15734, and the preservation unit is the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation Management Committee. The invention successfully realized the over-expression of xylene monooxygenase, benzyl alcohol dehydrogenase and benzaldehyde dehydrogenase from its own endogenous plasmid in Pseudomonas putida ATCC33015, and the whole-cell catalysis of the recombinant bacteria P. putida JN_18 to produce 5_methylpyrazine_2_carboxylic acid.
【技术实现步骤摘要】
一种重组恶臭假单胞菌及应用
本专利技术涉及一种重组恶臭假单胞菌及其用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，属于发酵工程领域。
技术介绍
5-甲基吡嗪-2-羧酸（5-Methylpyrazine-2-carboxylicacid，MPCA）是一种米白色固体结晶，分子式为C6H6N2O2，分子量为138.12，熔点166-169℃，是带有一个羧基和一个甲基的含氮杂环化合物。具有刺激性气味，当其暴露在空气中会被缓慢氧化，从棕色油状物变成棕黑色粘稠状固体，需要真空密封保存。是用于合成格列吡嗪、阿昔莫司及5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等药物的重要中间体以及作为金属配合物用于制备催化剂。5-甲基吡嗪-2-羧酸的结构式目前，5-甲基吡嗪-2-羧酸的合成主要依赖化学合成，如下（陈炳和等，化学试剂，2008，30（11）：869-870；董阳阳等，化学试剂，2013，35（6）：505-509）：（1）分子间环合法。以丙酮醛和二氨基马来腈为基本原料，在水、乙醇和乙酸体系中，两者环合得到2,3-二氰基-5-甲基吡嗪，然后在硫酸催化下氰基水解、脱羧得到目标化合物2-甲基吡嗪-5-羧酸；或是在催化剂焦亚硫酸钠的存在下，以丙酮醛和邻苯二胺为基本原料环合得到2-甲基苯并吡嗪，然后用高锰酸钾氧化得到5-甲基吡嗪-2,3-羧酸钾，再用硫酸进行酸化和脱羧得到目标化合物2-甲基吡嗪-5-羧酸。前者工艺路线简单，转化率较高，但是原料剧毒，工艺条件苛刻，未见工业化，后者原料易得，但是工艺合成路线较长，生产效率低，产品成本高。（2）吡嗪侧链多步合成法。以2,5-二甲基吡嗪为基本原料，合成路线分为：氯化、酰化、水解、氧化或者氧化、酰化、水解、氧化，较长的合成路线制约目标产物的收率，过程中有部分中间体易被氧化，使其工业化生产条件更为苛刻。（3）直接氧化法。以2,5-二甲基吡嗪为基本原料，把高锰酸钾溶于90℃的热水，然后缓慢滴加到2,5-二甲基吡嗪体系中，得到5-甲基吡嗪-2-羧酸的钾盐。最后，在0-5℃的冰水浴中，用浓盐酸酸析至pH值约为2.0，过滤得到目标化合物，粗产物收率40.08%。气相催化氧化法，则是将经氧化银改性的钒-钼氧化物为催化剂，气相催化氧化2,5-二甲基吡嗪为5-甲基吡嗪-2-羧酸和吡嗪-2,5-二羧酸。催化剂选择性较差，产生大量副产物，生产效率下降，成本增加。还存在着电化学合成法，它一般先采用化学合成法中的吡嗪侧链多步合成法得到一系列2,5-二甲基吡嗪的R基取代物，然后再电解氧化得到目标化合物。但是这些化学方法，需要高温高压，反应条件要求高，使用大量氧化剂，生产成本高，对环境污染较大。生物转化法制备5-甲基吡嗪-2-羧酸也有相关报导，其具有合成工艺简单，催化效率高，杂质少，对环境污染小等优点。目前国内主要是利用从土壤中筛选获得的菌株生物发酵进行生产，浙江工业大学（郑裕国等，化学与生物工程，2012，29（9）：19-25）筛选获得一株含二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌PseudomonasputidaZJB-LLJ，李广生等人（CN106434434B）在土壤中筛选出一新菌株HW-1。国外则是利用恶臭假单胞菌P.putidaATCC33015进行生产，但需要在培养基中添加芳烃类物质，如甲苯，二甲苯等等，激活XylR蛋白，从而调节内源性质粒的上游途径的Pu启动子，从而诱导相关酶的表达，而该类物质通常具有毒性，对环境也不友好。相关酶为甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)，在这三个酶的作用下，2,5-二甲基吡嗪先转化为5-甲基吡嗪-2-甲醇，再转化为5-甲基吡嗪-2-甲醛，最后变为5-甲基吡嗪-2-羧酸。因此，生产工艺简单，绿色环保且高效的5-甲基吡嗪-2-羧酸生产方法亟待开发。
技术实现思路
本专利技术旨在克服目前利用恶臭假单胞菌P.putidaATCC33015制备5-甲基吡嗪-2-羧酸方法上的不足，避免引入环境不友好的芳烃类物质，提供一种反应条件温和，环境友好的重组恶臭假单胞菌及其用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。本专利技术的技术方案是：一种重组恶臭假单胞菌PseudomonasputidaJN-18，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.15734，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年05月07日。本专利技术所述重组恶臭假单胞菌，包含编码二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的基因簇。所述编码二甲苯单加氧酶的基因xylM和xylA序列，分别对应NCBI-GeneID:1218754和NCBI-GeneID:1218743，所述苯甲醇脱氢酶的基因xylB序列对应NCBI-GeneID:9121238，所述苯甲醛脱氢酶的基因xylC序列对应NCBI-GeneID:1218745。本专利技术所述恶臭假单胞菌，以P.putidaATCC33015为宿主，以pRSFDuet-1为表达载体，并且将表达载体pRSFDuet-1的T7启动子替换成Tac启动子。本专利技术所述重组恶臭假单胞菌的制备方法，是以P.putidaATCC33015本身携带的内源性质粒为模板，PCR扩增获得二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因簇，与表达载体相连，再转化至恶臭假单胞菌中。本专利技术所述重组恶臭假单胞菌，能够以2,5-二甲基吡嗪为底物转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。本专利技术所述重组恶臭假单胞菌用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，以过表达二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的重组细胞为催化剂催化底物2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸，无需利用芳烃类物质诱导。本专利技术所述重组恶臭假单胞菌用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，以5-30g/L的2,5-二甲基吡嗪为底物，在20-40℃，pH6.0-8.5的条件下，转化12-60h。本专利技术的有益效果：本专利技术成功实现了来源于自身内源性质粒上的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶在恶臭假单胞菌P.putidaATCC33015中过表达，并以此重组菌P.putidaJN-18全细胞催化2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。与野生型恶臭假单胞菌P.putidaATCC33015相比，本专利技术无需在培养基中添加芳烃类物质诱导，这类物质通常具有毒性，如甲苯、二甲苯等，野生菌则需要利用这些物质来激活XylR蛋白，从而调节内源性质粒的上游途径的Pu启动子，诱导相关酶的表达。且反应条件温和，对环境污染小，底物选择性高，本技术专利技术也有利于解决化学合成法中污染严重，成本高的问题，其工艺简单，易于推广。附图说明图1为重组质粒的构建图；图2pH对全细胞转化的影响；图3温度对全细胞转化的影响；图4细胞量对全细胞转化的影响；图5底物2,5-二甲基吡嗪浓度对全细胞转化的影响；图6转化时间对全细胞转化的影响。具体实施方式菌株和质粒：质粒的复制采用大肠杆菌(EscherichiacoliJM109)为宿主，二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的表达和菌株发酵采用恶臭假单胞菌(P.putidaATCC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN‑18，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.15734。
【技术特征摘要】
1.一株重组恶臭假单胞菌PseudomonasputidaJN-18，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.15734。2.根据权利要求1所述重组恶臭假单胞菌PseudomonasputidaJN-18，其特征是，包含编码二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的基因簇，所述编码二甲苯单加氧酶的基因xylM和xylA序列，分别对应NCBI-GeneID:1218754和NCBI-GeneID:1218743，所述苯甲醇脱氢酶的基因xylB序列对应NCBI-GeneID:9121238，所述苯甲醛脱氢酶的基因xylC序列对应NCBI-GeneID:1218745。3.根据权利要求1所述重组恶臭假单胞菌PseudomonasputidaJN-18，其特征是，以P.putidaATCC33015为宿主，以pRSFDuet-1为表达载体，并且将表达载体pRSFDuet-1的T7启动子替换成Tac启动子。4.根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：李广生，刘龙，高永吉，刘炳朋，王永军，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：迪沙药业集团有限公司，江南大学，威海迪素制药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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