The invention relates to a gene cluster regulating the synthesis of milbemycin, a recombinant streptomyces, a preparation method and application thereof, belonging to the field of biotechnology. In view of the difficulty in isolation and purification of milbemycin at present, the present invention provides a gene cluster synthesized by milbemycin, which includes kelC gene, kelD gene and kelE gene, and a recombinant streptomyces, which is relative to the original strain producing the recombinant streptomyces, the genes kelC and kelE in the genome. Since at least one gene of kelD and kelE is inactivated, the present invention also provides the construction method of the recombinant Streptomyces and the method of producing milbemycin by using the recombinant streptomyces. The present invention is applicable to the production and purification of milbemycin.
【技术实现步骤摘要】
一种调控米尔贝霉素合成的基因簇、重组链霉菌及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物工程
,具体涉及一种调控米尔贝霉素合成的基因簇、重组链霉菌及其制备方法和应用。
技术介绍
生物药物尤其是大环内酯类正在并且越来越多地应用于兽医学和农业。米尔贝霉素(Milbemycin)是其中一个有代表性的对害虫具有广谱抑制同时具有较好的生态友好性的商业化农药及兽药。米尔贝霉素是一类十六元大环内酯类抗生素,化学结构与阿维菌素相似。米尔贝霉素1967年首次在日本被发现,并最先在日本登记为杀螨剂,用于农作物及经济作物等的害虫防治。之后在2006年于澳大利亚被登记用作集中花卉的二斑叶螨的杀螨剂。到现在,米尔贝霉素已在美国、中国、意大利等43个国家和地区被批准用于共24种农作物、经济作物及花卉的害虫防治。还有一些米尔贝霉素的衍生物也表现出非常好的生物活性,并进行了商业化的应用。如米尔贝肟是米尔贝霉素半合成产品,通常被用来预防恶丝虫病以及治疗钩虫和线虫等引起的猫和犬类疾病,同时还可以控制犬类的鞭虫病。此外,还有米尔贝霉素半合成药物乐平霉素(Lepimectin)被登记用于蔬菜和水果的鳞翅目、半翅类等害虫的防治,另外还有研究认为乐平霉素的衍生物可以用于治疗人类的皮肤病;半合成拉替菌素(Latidectin)也已商业化,用于防治动物寄生虫。尽管米尔贝霉素系列产品有巨大的商业价值,世界各国也争相研发产米尔贝霉素菌株,但都没有成功,近半个世纪来全球现仅日本Sankyo公司垄断生产米尔贝霉素原药。1999年课题组筛选出了产米尔贝霉素新菌株(CN101100651B、CN10046743C、C ...
【技术保护点】
1.一种调控米尔贝霉素合成的基因簇,其特征在于,所述基因簇包括kelC基因、kelD基因和kelE基因;所述基因kelC,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.4所示;所述基因kelD,其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.5所示;所述基因kelE,其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
【技术特征摘要】
1.一种调控米尔贝霉素合成的基因簇,其特征在于,所述基因簇包括kelC基因、kelD基因和kelE基因;所述基因kelC,其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.4所示;所述基因kelD,其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.5所示;所述基因kelE,其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。2.一种重组链霉菌,其特征在于,相对于产生该重组链霉菌的出发菌株,所述重组链霉菌基因组中的kelC基因、kelD基因和kelE基因中的任一个、任两个或全部三个基因失活:所述基因kelC,其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.4所示;所述基因kelD,其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.5所示;所述基因kelE,其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.6所示;所述重组链霉菌的出发菌株为冰城链霉菌Streptomycesbingchenggensis。3.根据权利要求2所述的重组链霉菌,其特征在于,所述冰城链霉菌为StreptomycesbingchenggensisBCWT、StreptomycesbingchenggensisBC-109-6、StreptomycesbingchenggensisBC-101-4、StreptomycesbingchenggensisBC-102-26、StreptomycesbingchenggensisBC-103-46、StreptomycesbingchenggensisBC-104-28、StreptomycesbingchenggensisX-4、StreptomycesbingchenggensisBC-X-1、StreptomycesbingchenggensisBCJ13、StreptomycesbingchenggensisBCJ36、StreptomycesbingchenggensisBC-120-4、StreptomycesbingchenggensisBCJ60、StreptomycesbingchenggensisBCJ60/pCMF、StreptomycesbingchenggensisBC04::milR中的任一种。4.一种权利要求2或3所述的重组链霉菌的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:1)目的基因阻断质粒的构建:以冰城链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得下述目的基因的同源重组的左臂片段及右臂片段,将左臂片段与右臂片段连入pKC1139载体骨架中,获得目的基因阻断质粒;2)将目的基因阻断质粒转化大肠杆菌,通过属间接合转移转入冰城链霉菌,获得目的基因阻断突变株,即为重组链霉菌。5.根据权利要求4所述的重组链霉菌的制备方法,其特征在于,步骤1)、步骤2)所述的冰城链霉菌为StreptomycesbingchenggensisBCWT、StreptomycesbingchenggensisBC-109-6、StreptomycesbingchenggensisBC-101-4、StreptomycesbingchenggensisBC-102-26、StreptomycesbingchenggensisBC-103-46、StreptomycesbingchenggensisBC-104-28、StreptomycesbingchenggensisX-4、StreptomycesbingchenggensisBC-X-1、StreptomycesbingchenggensisBCJ13、StreptomycesbingchenggensisBCJ36、StreptomycesbingchenggensisBC-120-4、StreptomycesbingchenggensisBCJ60、StreptomycesbingchenggensisBCJ60/pCMF、StreptomycesbingchenggensisBC04::milR中的任一种。6.根据权利要求4所述的重组链霉菌的制备方法,其特征在于,所述目的基因为下述基因基因的任一个、任两个或全部三个基因:1)基因kelC,其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.4所示;2)基因kelD,其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.5所示;3)基因kelE,其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示,其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。7.根据权利要求6所述的重组链霉菌的制备方法,其特征在于,目的基因同源重组片段扩增用的引物,为如下所述6种情况之一:①当失活的目的基因为kelC时,kelC基因同源重组左臂片段PCR扩增所用的引物:上游引物为:kelCDup-f:5'CCCA...
【专利技术属性】
技术研发人员:向文胜,王海燕,刘雨晴,成旭,王相晶,张继,
申请(专利权)人:中国农业科学院植物保护研究所,
类型:发明
国别省市:北京,11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。